高純度二苯乙烯苷制備工藝及其抗衰老機制研究.pdf

1、衰老,本世紀(jì)生物學(xué)研究重點課題,通常定義為正常狀況下生物發(fā)育成熟后,隨年齡增加,自身機能減退,內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降,細胞結(jié)構(gòu)、功能逐步退行性變異,趨向死亡,不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象,分為生理性衰老(正常衰老)、病理性衰老(異常衰老)兩種類型。尋找可延緩衰老進程的活性成分不僅是全世界人們的期望,更是醫(yī)藥研究者們的責(zé)任和義務(wù)。
　　二苯乙烯苷,源自素有抗衰老靈藥之稱的蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb,

2、其化學(xué)名為2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷;目前國內(nèi)外尚未見高純度二苯乙烯苷(含量>95.0％)規(guī)模生產(chǎn)工藝的報道。
　　既往研究表明,二苯乙烯苷對多種衰老相關(guān)疾病如動脈粥樣硬化、癌癥等病癥具有明顯治療作用,可清除體內(nèi)過量自由基,可能通過作用Sirtuin蛋白家族延緩衰老進程。藉此提示我們,二苯乙烯苷具有明確的抗衰老作用,但其抗衰老的作用靶點及其機制尚未闡明。
　　Klotho基因及分泌型Kloth

3、o蛋白,表達于遠端腎小管及腦脈絡(luò)叢,通過對胰島素/IGF-1信號通路及p53基因的調(diào)控影響衰老進程,是衰老機制研究的熱門靶點。
　　本課題綜合運用藥物化學(xué)、植物化學(xué)、藥理學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等實驗技術(shù)及方法,在優(yōu)化二苯乙烯苷提取分離純化工藝的基礎(chǔ)上,研究二苯乙烯苷抗衰老新靶點及其機制,為進一步研制抗衰老藥物提供新思路。
　　1二苯乙烯苷的提純工藝研究
　　1.1二苯乙烯苷提取:取何首烏飲片,用1-10%甘草-乙

4、醇溶液噴灑或稍浸,潤透,照《中國藥典》(2010年版一部,附錄ⅡD)蒸法,蒸至內(nèi)外均一色,曬干,粉碎成粗粉(10-40目),上樣于超臨界 CO2萃取儀的萃取釜中萃取,濃縮,萃取壓力30-40Mpa,萃取溫度60℃,萃取1-3小時,必要時可采用70-90%乙醇作為夾帶劑,用量為200-400ml/小時,得萃取液,濃縮。濃縮液上樣于硅膠柱層析(200-300目)純化,用20-80%乙醇梯度洗脫,流速為1.0ml/分鐘,收集洗脫液,蒸除乙醇,

5、得二苯乙烯苷粗品。
　　1.2二苯乙烯苷純化及含量測定方法:純化方法一,以乙酸乙酯萃取后反復(fù)重結(jié)晶為主要手段,獲得高純度二苯乙烯苷;方法二,通過大孔吸附樹脂吸附,獲得高純度二苯乙烯苷。含量測定采用 HPLC法,以乙腈和水為流動相,以稀乙醇定容待測樣品,建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=32899840x+123968,r=0.9994,精密度RSD=0.29%,重復(fù)性RSD=0.26%,穩(wěn)定性RSD=1.03%等。
　　1.3二苯乙烯苷中試

6、研究:二苯乙烯苷的提取率為2.65%(2.21-3.34%/8批次);按照方法一純化,二苯乙烯苷純度97.3%(95.6-98.7%/4批次),二苯乙烯苷平均產(chǎn)率80.4%,RSD=2.03%;方法二純化,二苯乙烯苷純度97.5%(96.2-98.3%/4批次),平均產(chǎn)率為85.0%,RSD=3.81%。
　　2二苯乙烯苷抗衰老作用靶點及其機制研究
　　2.1對果蠅生命周期的影響:以倍比稀釋法獲得二苯乙烯苷水溶液(2mg·m

7、l-1、20mg·ml-1、200mg·ml-1),加入果蠅培養(yǎng)基,以何首烏提取物加入果蠅培養(yǎng)基做參照,觀察各組50%果蠅存活時間、5%幸存果蠅存活時間、果蠅平均生命周期,表明二苯乙烯苷可提高果蠅攀爬能力,延長果蠅生命周期(雄14.3%、雌29.2%,p<0.01, vs.空白組),證實二苯乙烯苷具抗衰老作用。
　　2.2對病理性衰老小鼠的作用:用 D-半乳糖皮下注射的方法建立小鼠病理性衰老模型,48天后采用水迷宮法檢測小鼠記憶功

8、能,確定造模成功后,以二苯乙烯苷(含量≥70.0%,42mg·kg-1、84mg·kg-1、168mg·kg-1)生理鹽水溶液或等量生理鹽水給小鼠灌胃,每日一次,于給藥第29天及給藥第57天上午,麻醉采血后處死小鼠,制備血清,大腦、心臟、腎臟、睪丸、附睪組織勻漿和組織蠟塊備用。以水迷宮實驗配合ELISA試劑盒、熒光實時定量PCR、免疫組化、HE染色法及病理切片進行測定,結(jié)果:①二苯乙烯苷可改善小鼠因病理性衰老引起的記憶衰退并調(diào)節(jié)體重至健

9、康范圍;②減少小鼠血清中自由基、一氧化氮、IGF-1含量(p<0.01,vs.空白組);③提高血清中超氧化物歧化酶、鈣離子、Klotho蛋白水平(p<0.01,vs.空白組);④促進大腦及腎臟中 Klotho基因表達(p<0.01,vs.空白組);⑤增加 Klotho蛋白在大腦、心臟、腎臟、睪丸、附睪中表達(p<0.01,vs.空白組),且8周藥效優(yōu)于4周,168mg·kg-1優(yōu)于其它兩劑量組。說明二苯乙烯苷能調(diào)控病理性衰老小鼠體內(nèi)Kl

10、otho基因及蛋白表達,其抗衰老機制與Klotho基因及蛋白相關(guān)。
　　2.3對生理性衰老小鼠的作用:選用18月齡、雄性、自然衰老小鼠,灌胃給予二苯乙烯苷(含量≥95.0%,124mg·kg-1)生理鹽水溶液,對照組給予何首烏提取物(二苯乙烯苷含量≥70.0%,168mg·kg-1)生理鹽水溶液,空白組給予等量生理鹽水,每日一次,給藥8周后,第57天上午,麻醉采血后處死小鼠,制備血清,大腦、心臟、腎臟、皮膚組織勻漿和組織蠟塊備用。

11、采用ELISA試劑盒配合熒光實時定量PCR、免疫組化、HE染色法、western blot及病理切片,發(fā)現(xiàn):①二苯乙烯苷可減輕老年小鼠體重,減少老年小鼠皮下脂肪細胞數(shù)量、厚度及面積(p<0.01,vs.空白組),促進Klotho蛋白在腎臟、大腦表達(p<0.01,vs.空白組),降低大腦及腎臟中胰島素、胰島素受體、IGF-1水平(p<0.01,vs.空白組),降低腎臟及心臟中 IGF-1受體水平(p<0.01,vs.空白組);②何首烏提

12、取物可降低腎臟中胰島素、IGF-1水平(p<0.01,vs.空白組),降低腎臟及心臟中胰島素受體水平(p<0.01,vs.空白組),升高大腦及心臟中胰島素水平(p<0.01,vs.空白組),升高心臟中IGF-1水平(p<0.01, vs.空白組),升高腎臟及大腦中IGF-1受體水平(p<0.01,vs.空白組)。
　　綜上,以何首烏為原料,優(yōu)化并制定了二苯乙烯苷提取和純化制備工藝,以“一種二苯乙烯苷注射劑及其制備工藝”申報中國發(fā)明