自發(fā)性高血壓合并糖尿病大鼠基礎(chǔ)上永久性大腦中動(dòng)脈阻塞模型的初步研究.pdf

1、研究背景:缺血性卒中發(fā)病率高，致死、致殘率高，是一種嚴(yán)重的世界性疾病負(fù)擔(dān)。高血壓、糖尿病是缺血性卒中的重要危險(xiǎn)因素。缺血性卒中相關(guān)的動(dòng)物研究中，較多地采用了正常鼠，或是單純高血壓或糖尿病鼠。為了探索和建立一個(gè)更符合臨床起病特點(diǎn)的動(dòng)物模型，本課題擬使用自發(fā)性高血壓大鼠，結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)及腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病狀態(tài)，并在此基礎(chǔ)上建立永久性大腦中動(dòng)脈阻塞模型。通過(guò)對(duì)大鼠的體重、血壓、血糖、血脂以及內(nèi)皮損傷指標(biāo)的監(jiān)測(cè)，結(jié)合腦部大中動(dòng)脈的病

2、理改變，對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，并在此基礎(chǔ)上建立永久性大腦中動(dòng)脈阻塞模型來(lái)明確高血壓合并糖尿病狀態(tài)對(duì)缺血性腦損傷的影響，并探究其具體影響機(jī)制。
　　第一部分、自發(fā)性高血壓合并糖尿病大鼠模型的建立
　　目的:建立自發(fā)性高血壓合并糖尿病大鼠模型;觀察并比較該模型大鼠與正常大鼠腦動(dòng)脈的病理改變。
　　方法:將21只自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)隨機(jī)分成6組:糖尿病組(SHR-DM，8只)，高脂飲食組（SHR-H，7只），普通飲食對(duì)照組（

3、SHR-C，6只）;將22只wistar大鼠分為:糖尿病組（wistar-DM，9只），高脂飲食組（wistar-H，7只），普通飲食對(duì)照組（wistar-C，6只）。經(jīng)過(guò)12周的高脂或普通飼料喂養(yǎng)后，予以腹腔注射鏈脲佐菌素或檸檬酸緩沖液。每周監(jiān)測(cè)大鼠體重、血壓、血糖的變化;第16周及20周留取血清，測(cè)定血清的血脂水平（總膽固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白）以及內(nèi)皮損傷指標(biāo)（內(nèi)皮素-1，6-酮-前列腺素-1α）;第20周灌流取

4、腦，制備冰凍切片，行HE染色觀察腦動(dòng)脈的病理改變，并行masson染色觀察其血管壁膠原分布情況。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)中有6只大鼠死亡，其中SHR-DM組2只，SHR-H組1只，wistar-DM組3只，總體死亡率13.9％。腹腔注射鏈連脲佐菌素后，糖尿病組大鼠的血糖水平一直維持在16.7mmol/l之上。對(duì)各組大鼠的血脂水平比較發(fā)現(xiàn)，第20周時(shí)SHR-DM組的總膽固醇，甘油三酯及低密度脂蛋白分別為3.01±0.22mmol/l，1.8

5、4±0.38mmol/l，和2.34±0.39mmol/l，較SHR-C組的1.93±0.11mmol/l，0.63±0.20mmol/l和1.39±0.11mmol/l顯著升高(p＜0.01)，其高密度脂蛋白為0.47±0.092mmol/l較SHR-C組的0.90±0.16mmol/l明顯減少(p＜0.01)。Wistar-DM組的血脂水平與wistar-C組比較，其總膽固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白均較wistar-C組顯著升高(p

6、＜0.01)，其高密度脂蛋白較wistar-C組明顯減少(p＜0.01)。再對(duì)大鼠的血清中內(nèi)皮素-1和6-酮-前列腺素-1α分析發(fā)現(xiàn)，第20周SHR-DM組的內(nèi)皮素-1水平為30.86±6.15pg/ml，較SHR-C組的13.49±4.20pg/ml顯著升高(p＜0.01)，而其具備舒張血管功能的6-前列腺素-1α在SHR-DM組為247.28±6.60pg/ml，較SHR-C組的333.73±22.89pg/ml顯著下降(p＜0.0

7、1)，提示SHR-DM組內(nèi)皮功能受損。腦片的HE染色顯示:SHR-DM組腦底大中動(dòng)脈的管壁較SHR-H，SHR-C組增厚，平滑肌細(xì)胞核變鈍圓，排列紊亂;三個(gè)SHR組腦實(shí)質(zhì)小動(dòng)脈呈現(xiàn)出管壁增厚的改變;masson染色顯示SHR-DM組血管壁膠原沉積較其他組增多。
　　小結(jié):
　　1.通過(guò)高脂飲食合并腹腔鏈脲佐菌素可以成功建立自發(fā)性高血壓合并糖尿病大鼠模型;
　　2.該模型出現(xiàn)血脂水平升高，內(nèi)皮素-1的升高，和6-前列腺素

8、-1α下降，符合糖尿病模型的規(guī)律;
　　3.通過(guò)腦部切片HE染色及masson染色發(fā)現(xiàn)，該模型已出現(xiàn)早期的動(dòng)脈粥樣硬化改變，為下一步實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　第二部分、自發(fā)性高血壓合并糖尿病大鼠基礎(chǔ)上永久性大腦中動(dòng)脈阻塞模型的初步研究
　　目的:應(yīng)用改良栓線法在前述自發(fā)性高血壓合并糖尿病大鼠模型基礎(chǔ)上建立永久性大腦中動(dòng)脈阻塞模型，與自發(fā)性高血壓大鼠及wistar大鼠相比較，觀察成模率以及各組腦梗塞體積的變化;比較各組MAPK

9、通路的表達(dá)以探究該通路與糖尿病高血壓狀態(tài)加重缺血性腦損傷的關(guān)系。
　　方法:將200-220g的SPF級(jí)雄性SHR大鼠30只隨機(jī)分成四組:合并糖尿病SHR大鼠，行MCAO（SHR-DM，9只）;合并糖尿病SHR大鼠，行假手術(shù)(SHR-DM-sham，6只);普通飲食SHR大鼠，行MCAO（SHR-C，9只）;普通飲食SHR大鼠，行假手術(shù)（SHR-C-sham，6只）;將200-220g的SPF級(jí)雄性wistar大鼠15只分為兩組:

10、普通飲食wistar大鼠，行MCAO（wistar-C，9只）;普通飲食wistar大鼠，行假手術(shù)（wistar-C-sham，6只）。根據(jù)前述方法建立自發(fā)性高血壓合并糖尿病大鼠模型后，分別予以行永久性大腦主動(dòng)脈阻塞(MCAO)術(shù)或假手術(shù)，術(shù)后24h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。通過(guò)焦油紫染色比較各組大鼠腦梗塞體積及腦水腫體積的情況;通過(guò)NeuN染色測(cè)定梗死周邊和梗死核心區(qū)神經(jīng)元存活的情況;通過(guò)免疫熒光檢測(cè)MAPK通路的p-p38，p-JNK，p

11、-ERK在各組梗死周邊的表達(dá)。
　　結(jié)果:行MCAO術(shù)前，SHR-DM，SHR-C，wistar-C各有一只大鼠死亡。在接受MCAO術(shù)的24只大鼠中，術(shù)后24h內(nèi)死亡5只，其中SHR-DM2只，SHR-C2只，wistar-C1只，手術(shù)的總體成功率為79.2％。共有37只大鼠最終入組。術(shù)后24h各組的神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行比較，SHR-DM組為1.33±0.44，與SHR-C及wistar-C(均為1.00±0.00)相比較有增高趨勢(shì)，

12、但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.154)。各組的梗死體積相比較，SHR-DM為0.52±0.033，較SHR-C，wistar-C(分別為0.28±0.023和0.25±0.013)顯著增大(p＜0.01)。三組腦水腫體積差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NeuN染色提示SHR-DM組在梗死核心的神經(jīng)元存活與SHR-C及wistar-C組明顯減少。MAPK通路的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，SHR-DM組在梗死周邊的p-ERK較SHR-C及wistar-C組顯著