I-Aβ-,1-基因與實驗性小鼠膜性腎小球腎炎的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：膜性腎小球腎炎(membranous glomerulonephritis，MGN)，又稱膜性腎病(membranous nephropathy，MN)，是引起成人腎病綜合征最常見的原因。多數(shù)患者預(yù)后差。MGN的發(fā)病機制還不甚明了，目前的研究認為與免疫反應(yīng)有關(guān)，而和免疫功能密切相關(guān)的是MHC基因。本研究擬對控制免疫應(yīng)答的Ir基因(immune responsegene)I-Aβ1片斷進行研究，探討其與小鼠MGN發(fā)病機制的關(guān)系，以期

2、論證Ir基因在腎炎發(fā)病中的重要地位和作用，揭示其分子病理學(xué)發(fā)病機制。 方法： 1．復(fù)制與鑒定小鼠膜性腎小球腎炎動物模型。按照Border[1]方法，制備陽離子化牛血清白蛋白(cationic bovineserum albumin，C-BSA)。選用近交系BLAB/c小鼠30只，20±2g，雌雄對半，隨機分為實驗組和對照組2組。實驗組隔日尾靜脈注射C-BSA0.2 ml，對照組小鼠隔日注射0.2 ml生理鹽水(NS)，進

3、行全程對照，于注射第3周起每周檢測每只小鼠尿蛋白2次，四周末殺檢，進行光鏡、電鏡、免疫熒光染色鑒定。 2．以逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerize chain reaction，RT-PCR)方法擴增并鑒定I-Aβ1基因。隨機選取上述膜性腎病動物模型實驗組和對照組小鼠，分別作為I-Aβ1基因序列的實驗組和對照組。取小鼠脾臟組織提取總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)

4、，并鑒定RNA的純度和完整性，用RT-PCR技術(shù)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸(complementary deoxyfibonucleic acid，cDNA)，并對I-Aβ1基因cDNA全序列進行體外擴增。 3．設(shè)計擴增產(chǎn)物內(nèi)部特異性引物對PCR產(chǎn)物進行測序。 4．測序結(jié)果分析。將測序結(jié)果分別在BLAST上進行雙重序列對比，以及Clustalx1.83多重序列對比。以雜合突變數(shù)、干擾峰數(shù)及突變位點進行統(tǒng)計分析

5、。 結(jié)果： 1．以Border法制備陽離子化牛血清白蛋白，小鼠尾靜脈注射制備動物模型穩(wěn)定可靠。 2．用Trizol試劑提取總RNA，總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，示A260/A280在1.77～1.93之間，提示RNA純度較好；1％瓊脂糖凝膠電泳可見28s、18s、5s三條帶，28s和18s條帶明亮、清晰，并且28s的亮度在18s條帶的兩倍以上，表明提取的總RNA完整性好。 3．逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增實驗組和對

6、照組目的基因，擴增產(chǎn)物與脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)分子Marker相比較示：擴增產(chǎn)物大小在300～400 bp之間，與預(yù)期350 bp相符，陰性對照組(未加cDNA組)無產(chǎn)物。 4．送檢實驗組和對照組各10例PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果送檢20例均峰圖明顯，雜帶較少，可獲得清晰序列，實驗組和對照組序列在BLAST上與正常序列對比，符合率分別為99.71％和99.94％；將序列文件中序列與DNA

7、序列峰圖對比，以峰圖為準，校準每例標本的序列，用Clustalx1.83對實驗組、對照組以及正常BLAB/c小鼠基因序列進行多重序列對比，結(jié)果實驗組、對照組以及正常小鼠基因序列均一致。 5．雜合突變分析顯示：實驗組突變率為2.578‰，高于PCR擴增所致突變率(P<0.01)；對照組突變率為0.286‰，也高于PCR擴增所致突變率(P<0.01)。實驗組和對照組比較，實驗組突變率明顯高于對照組(P=0.011<0.05)。

8、 6.對實驗組和對照組的干擾峰進行統(tǒng)計分析，實驗組干擾峰的發(fā)生率為2.865‰，對照組為0.572‰，實驗組比對照組更易出現(xiàn)干擾峰(P=0.021<0.05)。7.對實驗組雜合位點進行分析。結(jié)果P=0.436>0.05，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，尚不能認為四個位點之間突變的發(fā)生率有差異。 結(jié)論： 1.小鼠MGN模型建立成功。 2.I-Aβ1基因在實驗性膜性腎病小鼠中雜合突變率和干擾峰出現(xiàn)率均增高，可能和小鼠膜性腎病發(fā)