褪黑素緩釋制劑的研究.pdf

1、褪黑素(melatonin,MLT)是大腦下部松果體分泌的重要激素,由色氨酸合成,屬于吲哚類物質(zhì)。在體內(nèi)可以與特定受體結(jié)合產(chǎn)生一定的生物學(xué)效應(yīng),主要有:免疫調(diào)節(jié)作用,可以增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤和降血壓；清除自由基及抗氧化作用,可以對細(xì)胞核DNA起到保護(hù)作用,還可以保護(hù)大腦免受自由基氧化損害。褪黑素的體內(nèi)分泌受年齡的影響,隨年齡的增大分泌減少,成年人適當(dāng)補(bǔ)充外源性褪黑素可以延緩衰老,還可預(yù)防高血壓,心臟病,動(dòng)脈硬化等多種老年性疾??；神經(jīng)系統(tǒng)方

2、面可以起到鎮(zhèn)靜調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)的作用,常用于消除時(shí)差反應(yīng),改善睡眠障礙等疾??；在生殖系統(tǒng)方面,有抑制性腺和副性腺發(fā)育,用于皮毛動(dòng)物飼養(yǎng)上可以促進(jìn)其皮毛發(fā)育和成熟,提高經(jīng)濟(jì)效益。褪黑素為內(nèi)源性物質(zhì),毒副作用小,用途廣泛,有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。
　　 目前,褪黑素用于人體的劑型有片劑和口服液等；用于動(dòng)物增加皮毛生長的劑型有緩釋片或硅膠管埋植棒,現(xiàn)已上市的硅膠管埋植棒可緩釋3個(gè)月。由于褪黑素口服首過效應(yīng)大,生物利用度低,半衰期短,需頻繁或

3、大劑量給藥,限制了其在人和動(dòng)物體中的應(yīng)用。
　　 本課題采用生物相容性好、生物可降解的磷脂、膽固醇和乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacids,PLGA)等載體材料將褪黑素制備成脂質(zhì)體及微球等長效緩釋制劑,并且將脂質(zhì)體、微球與以具備熱反相膠凝特性的泊洛沙姆407(商品名PluronicF127,PF127)為載體材料制備原位凝膠,用于皮下注射植入。既可以達(dá)到長效緩釋的效果,又有效的避免了生物不可

4、降解材料植入劑生物相容性差,植入過程復(fù)雜以及給病人帶來痛苦等缺點(diǎn)。為進(jìn)一步開發(fā)褪黑素廣泛的生理學(xué)用途提供了可能。本文主要研究內(nèi)容包括:
　　 1褪黑素脂質(zhì)體的研究建立了MLT的含量測定方法；采用薄膜分散法制備MLT脂質(zhì)體；以包封率為主要評價(jià)指標(biāo),在單因素考察的基礎(chǔ)上,采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化處方和工藝；通過電子透射顯微鏡觀察脂質(zhì)體外觀形態(tài)；激光散射粒度儀測定粒徑和Zeta電勢；以褪黑素溶液為對照,采用動(dòng)態(tài)膜透析法測定MLT脂質(zhì)體體外釋放

5、百分率并對其釋藥動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究；通過影響因素考察評價(jià)MLT脂質(zhì)體初步穩(wěn)定性。結(jié)果表明,紫外分光光度法作為測定脂質(zhì)體中MLT含量的方法,專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性及靈敏性好,操作簡便；在單因素考察基礎(chǔ)上,經(jīng)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)得最優(yōu)處方為:藥脂比為1:25、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為10:1,溫度40℃；透射顯微鏡下觀察脂質(zhì)體外觀形態(tài)為圓整的球形小囊,平均粒徑為(5.542±0.04)μm,Zeta電勢為(-31.68±1.29)mV,包封率為(77.23±2

6、.51)％；與MLT溶液相比,MLT脂質(zhì)體體外釋藥有明顯的緩釋作用(從10h延長至72h),體外釋藥更好地符合雙相動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型(100-Q=105.64e-0.3156t+44.19e-0.0492t,Rα=0.9886,Rβ=0.9874)。初步穩(wěn)定性試驗(yàn)表明脂質(zhì)體更宜低溫保存。
　　 2褪黑素PLGA微球的研究采用O/W型乳化-溶劑揮發(fā)法制備褪黑素PLGA微球,紫外分光光度法測定微球的包封率及載藥量。以包封率為評價(jià)指標(biāo),在

7、單因素考察的基礎(chǔ)上,采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化處方和工藝；采用光學(xué)顯微鏡觀察微球的外觀形態(tài)；激光散射粒度分析儀測定微球的粒徑及粒度分布；動(dòng)態(tài)膜透析法測定MLT-PLGA-MS體外釋放行為,以零級動(dòng)力學(xué)方程,一級動(dòng)力學(xué)方程、Higuchiequmion、Weibullequmion、Ritger-Peppasequation和Bioexponentialequation等數(shù)學(xué)模型對微球體外釋藥動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行擬合,分析體外釋藥機(jī)理；采用DSC法驗(yàn)

8、證微球的形成；通過微球初步穩(wěn)定性考察,為將來制劑的包裝及貯存條件提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　 單因素考察結(jié)果表明影響微球包封率的主要因素為聚乙烯醇(polyvinylalcohol,PVA)濃度、PLGA濃度、二氯甲烷和丙酮體積比。經(jīng)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選的最優(yōu)處方及制備工藝為:PVA濃度為3％,PLGA的濃度為40mg·mL-1,二氯甲烷和丙酮體積比為3:1,機(jī)械攪拌制備初乳的速度與時(shí)間為2,000r·min-1、90s,磁力攪拌除去有機(jī)溶

9、劑的速度與時(shí)間為400r·min-1、4h；加入2％的甘露醇作為凍干保護(hù)劑,采用低溫冷凍干燥法制備干燥MLT微球；DSC試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了微球的形成。采用優(yōu)化處方和工藝制備的三批褪黑素PLGA微球,外觀為白色粉末,光學(xué)顯微鏡下觀察其外觀形態(tài)為球形,無粘連；平均粒徑為(15.605±2.19)μm；平均包封率為(76.57±1.64)％；體外釋放可持續(xù)3個(gè)月,服從零級釋放模型(Q=0.0347t+3.5569,r=0.9549),呈現(xiàn)良好的緩

10、釋效果；加速試驗(yàn)及長期試驗(yàn)條件下考察,6個(gè)月內(nèi)無明顯變化,穩(wěn)定性良好。
　　 3褪黑素脂質(zhì)體、褪黑素微球原位凝膠劑的制備及體外釋藥性研究采用傾斜法測定凝膠的膠凝溫度,以能否獲得適宜膠凝溫度(20～36.5℃)及室溫條件下凝膠的通針性為依據(jù)篩選PF127原位凝膠處方,將制備的褪黑素脂質(zhì)體和微球分散于原位凝膠中,以MLT凝膠劑為對照,采用動(dòng)態(tài)膜透析法測定MLT脂質(zhì)體凝膠劑和MLT微球凝膠劑體外釋藥特性,并分別進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合,分析其

11、釋藥機(jī)理。結(jié)果表明,制備脂質(zhì)體及微球凝膠的PF127最優(yōu)濃度為18％；制備的脂質(zhì)體原位凝膠和微球原位凝膠膠凝溫度分別為(23.3±0.3)℃和(22.8±0.4)℃,且在20℃以下通針性良好；體外釋放試驗(yàn)結(jié)果表明,MLT脂質(zhì)體凝膠劑與MLT凝膠劑相比有較好的緩釋效果(釋放時(shí)間從36h延長到120h),體外釋放服從一級動(dòng)力學(xué)模型(ln(100-Q)=-0.0258t+4.2292,r=0.9695)；MLT微球凝膠與MLT凝膠劑相比有明顯

12、的緩釋效果(釋放時(shí)間從36h延長到2184h),體外釋放服從零級動(dòng)力學(xué)模型(Q=0.037t+1.6731,r=0.9661)。由此可知,MLT微球凝膠劑較MLT脂質(zhì)體凝膠劑緩釋效果更明顯。
　　 4MLT-MS-GEL藥代動(dòng)力學(xué)研究采用高效液相色譜電化學(xué)檢測器測定大鼠血漿中褪黑素濃度,建立血藥濃度檢測方法并進(jìn)行方法學(xué)考察。將釋放持續(xù)時(shí)間最久的原位凝膠制劑皮下注入大鼠皮下,以市售可緩釋3個(gè)月的動(dòng)物用硅膠管植入棒為對照制劑,對制備

13、的長效緩釋原位凝膠制劑進(jìn)行體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。
　　 方法學(xué)考察結(jié)果表明,所選色譜條件及藥物提取方法專屬性好,靈敏度高,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾藥物的測定。血藥濃度在0.1～10μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(A=9829.4c-2155,r=0.9991),日內(nèi)、日間精密度RSD分別為小于3％和5％,方法回收率大于98％,提取回收率大于75％,RSD均小于3％,滿足生物樣品測定要求。
　　 以市售動(dòng)物用硅膠管植入棒為對照,研

14、究大鼠皮下注射褪黑素微球原位凝膠后體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特性,血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用DASver2.0藥代動(dòng)力學(xué)程序處理,按統(tǒng)計(jì)矩法求得到藥動(dòng)學(xué)參數(shù),結(jié)果表明,對照組和微球組血漿中AUC分別為5358.566μg·mL-1·h-1和5562.251μg·mL·h-1；平均滯留時(shí)間(MRT)分別為1014.304h和1090.405h；t1/2分別為68.593h和69.315h；表觀分布容積分別為0.330L·kg和0.181L·kg,對照組為微

15、球組的1.82倍。結(jié)果表明,制備的MLT微球原位凝膠在動(dòng)物體內(nèi)可以達(dá)到與市售硅膠管埋植棒相同的效果,更多的藥物進(jìn)入體內(nèi)大循環(huán)。由血藥濃度曲線可見,在體內(nèi)釋放后期,微球原位凝膠維持比硅膠管埋植棒略高的血藥濃度,達(dá)到穩(wěn)定血藥濃度的效果。
　　 結(jié)論:本課題將褪黑素脂質(zhì)體和微球制劑與原位凝膠結(jié)合起來,成功研制了具有長效緩釋效果的褪黑素新型可注射植入劑。脂質(zhì)體、微球制劑的制備工藝簡便可行,具有良好的重現(xiàn)性和理想的包封率,體外釋放有明顯的

16、緩釋效果。將其以注射劑(靜脈注射或皮下注射)應(yīng)用于人體,能延長藥物半衰期,提高生物利用度,擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍。
　　 將褪黑素脂質(zhì)體和微球分散于一定濃度的PF127原位凝膠中,制備常溫下可注射給藥的脂質(zhì)體、微球原位凝膠。選擇其中體外釋放時(shí)間最長的微球凝膠制劑進(jìn)行大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)考察,與市售硅膠管埋植劑相比可發(fā)揮同樣的緩釋長效作用,與此同時(shí)還避免了硅膠管植入劑在應(yīng)用上的不足,不需手術(shù)植入,只需通過注射器皮下注射即可在植入部位形成藥物