修飾的腫瘤抗原肽CEA-,610D-疫苗抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 腫瘤抗原肽即TCR（T cell receptor，TCR）所識別的與MHC分子結(jié)合的8-12個氨基酸的短肽，為腫瘤抗原的重要組成成分，是誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是相對分子質(zhì)量為180KD的膜胞間黏附糖蛋白，作為最為重要的腫瘤相關(guān)抗原之一，主要表達(dá)在結(jié)腸、直腸、胃、胰腺腫瘤、70％以上的肺癌和50％左右的乳腺癌中，是一種高效且較為理想的靶抗原。目

2、前，選擇以CEA為靶點(diǎn)的腫瘤生物治療具有普遍的臨床意義。但研究表明，天然肽抗原CEA605-613屬自身抗原，免疫原性弱，易引起免疫耐受，臨床實(shí)驗(yàn)未能觀察到足夠強(qiáng)度的特異性抗腫瘤應(yīng)答。因此，本研究選擇天然表位CEA605-613（YLSGANLNL）在6位上以天冬氨酸代替天冬酰氨，采用固相合成法合成新的修飾CEA抗原肽疫苗（CEA610D），提高抗原肽的免疫原性，增加肽與復(fù)合物的穩(wěn)定性，并通過體外誘導(dǎo)肽特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cyto

3、lytic T lymphocyte，CTL）產(chǎn)生特異性抗腫瘤應(yīng)答，評價其體外抗腫瘤免疫的有效性，且從分子及基因水平上闡明其激活免疫細(xì)胞和介導(dǎo)細(xì)胞毒作用的抗腫瘤機(jī)制，為疫苗的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．化學(xué)合成法合成CEA修飾肽（CEA610D）、天然肽和HLA-A2無關(guān)肽。 2．RT-PCR法篩選表達(dá)CEA、HLA-A2表型的人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞株T84及表達(dá)CEA非HLA-A2表型的人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞

4、株lovo；檢測活化的CTL細(xì)胞殺傷相關(guān)介質(zhì)穿孔素的表達(dá)水平。 3．MTT法檢測，絲裂霉素C（MMC）對HLA-A2人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的抑制作用；同種異體混合淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)；肽誘導(dǎo)的CTL的增殖活性及對T84、lovo腫瘤細(xì)胞的特異靶向殺傷作用。 4．采用人同種異體單向混合淋巴細(xì)胞HLA-A2表型與肽共孵育的方法誘導(dǎo)特異性殺傷T細(xì)胞（CTL）。 5．流式細(xì)胞術(shù)觀察CTL細(xì)胞表面CD3、CD4、CD

5、8的表達(dá)變化。 6．ELISA法檢測CTL培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平。 結(jié)果： 1．采用多肽固相合成法合成天然肽CEA605-613序列為YLSGANLNL。對天然肽在原氨基酸610位點(diǎn)上以天冬氨酸替換天冬酰胺，合成修飾的CEA抗原肽CEA610D，序列為YLSGADLNL。合成無關(guān)肽MAGE-3，序列為LLIIVLAII。 2．25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml不同質(zhì)量濃度

6、的MMC，作用于HLA-A2人PBMC30分鐘后，對PBMC均有明顯的抑制作用（P<0．05）。 3．將25μg/ml、50μg/ml質(zhì)量濃度的MMC制備的HLA-A2人PBMC刺激細(xì)胞，與異體的外周血PBMC共培養(yǎng)48h，其中25μg/ml組增殖指數(shù)為1．34，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)增殖最為顯著（p<0．05）。 4．在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)系中分別加入CEA610D、CEA天然肽及無關(guān)肽，并添加細(xì)胞因子rhIL-2，共孵育5d，

7、收獲三種肽特異性CTL細(xì)胞。其中CEA610D組的CTL細(xì)胞增殖較對照組相比最為顯著（p<0．05）。 5．CEA610D刺激的同種異體混合淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的表型為CD3+CD8+的CTL細(xì)胞所占比例為38．0％，與天然肽組及無關(guān)肽組的35．5％和36．1％相比，略有增高。 6．抗原肽特異性CTL對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用，在效靶比分別為10：1、20：1、40：1時，CEA610D組誘導(dǎo)的CTL對高表達(dá)CEA的HLA-A2結(jié)

8、腸癌細(xì)胞T84的殺傷活性最強(qiáng)，分別是（36．1±3．57）％、（47．1±1．86）％和（56．7％±3．73），顯著高于無關(guān)肽組（P<0．01）；而對非HLA-A2的高分泌CEA的lovo結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷活性維持在較低的水平，分別為（19．4±0．99）％、（23．7±0．50）％和（26．5±3．54）％。表明修飾的肽疫苗能夠有效誘導(dǎo)特異性CTL細(xì)胞，并且殺傷作用是HLA-A2限制性的針對CEA的特異殺傷。 7．CEA610

9、D組CTL細(xì)胞殺傷相關(guān)介質(zhì)穿孔素mRNA表達(dá)水平呈高表達(dá)，其相對定量值為0．58，顯著高于天然肽組的0．50及無關(guān)肽組的0．42。 8．CEA610D組所誘導(dǎo)的肽特異性CTL細(xì)胞上清IFN-γ分泌水平為（1399．80±11．86）pg/ml，明顯高于無關(guān)肽組（P<0．01）。 結(jié)論： 1．修飾的CEA610D抗原肽與天然肽疫苗相比，可提高免疫原性；與無關(guān)肽疫苗相比，可打破免疫耐受，具有顯著增強(qiáng)和激活特異性CTL

10、增殖、分化的能力，提高細(xì)胞誘導(dǎo)體系中CD3+CD8+CTL細(xì)胞的比率。 2．修飾的CEA610D抗原肽疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL細(xì)胞，特異性殺傷高表達(dá)CEA且為HLA-A2限制性的T84結(jié)腸癌細(xì)胞，而對高表達(dá)CEA且非HLA-A2限制性的lovo腫瘤株殺傷作用較弱，提示其抗腫瘤作用為HLA-A2限制性的針對CEA的特異性殺傷。 3．修飾的CEA610D抗原肽疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL細(xì)胞殺傷活性顯著增強(qiáng)的機(jī)制，可能與上調(diào)釋放殺傷介質(zhì)