Goldenhar綜合征外周血B淋巴細(xì)胞永生系的建立及Goldenhar綜合征家系致病基因的初步研究.pdf

1、第一部分 Goldenhar綜合征家系及散發(fā)病例外周血B淋巴細(xì)胞永生系的建立
　　 目的:
　　 采用EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞技術(shù)，建立Goldenhar綜合征家系及散發(fā)病例外周血B淋巴細(xì)胞永生細(xì)胞系。
　　 方法:
　　 收集湖南懷化地區(qū)的一個Goldenhar綜合征家系中目前存活的3代20人及4例Goldenhar綜合征散發(fā)病例及其父母外周血樣品，進行淋巴細(xì)胞分離，以EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，并加入環(huán)孢素霉A

2、抑制T淋巴細(xì)胞生長，每個血樣采用兩線同時培養(yǎng)，光鏡觀察B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況。轉(zhuǎn)化后進行細(xì)胞株的凍存和復(fù)蘇，檢測細(xì)胞凍存后復(fù)蘇成功率，用染色體G顯帶技術(shù)進行細(xì)胞遺傳學(xué)檢測，分析建系前后家系及散發(fā)病例的核型，并確定其建系的遺傳穩(wěn)定性。
　　 結(jié)果:
　　 培養(yǎng)1周左右，可在倒置顯微鏡下觀察到B淋巴細(xì)胞明顯母細(xì)胞化，細(xì)胞明顯增大，細(xì)胞周邊可見明顯的胞質(zhì)突起，形狀各異，聚集成團。約15d后，可見白色聚集生長的細(xì)胞團，1個月左右細(xì)

3、胞增殖形成生長密集的細(xì)胞集落。共建成Goldenhar綜合征患者外周血永生細(xì)胞株8例，建株成功率100％，父母等家庭成員建系成功率為95.8％(23/24)。所有建成的細(xì)胞系凍存1，3，6個月后復(fù)蘇成功率為100％。染色體G顯帶結(jié)果表明，建系前后患者及其家庭成員染色體核型無異常，排除了大片段染色體畸形導(dǎo)致臨床表型的可能性，并表明建立細(xì)胞株的方法穩(wěn)定。
　　 結(jié)論:
　　 所有患者及其家庭成員染色體核型正常，成功建立了Go

4、ldenhar綜合征患者永生細(xì)胞系。
　　 第二部分 Goldenhar綜合征家系已知區(qū)間14q32檢測和EYA1基因突變篩查
　　 目的:
　　 為探索Goldenhar綜合征的致病基因，對Goldenhar家系進行已知區(qū)間14q32的檢測，并篩查Goldenhar綜合征患者的EYA1基因突變。
　　 方法:
　　 (1)選取4個位于14q32上已知與Goldenhar家系相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記物，并

5、進行多重PCR擴增，經(jīng)ABI3130型遺傳分析儀，Genescan收集數(shù)據(jù)，Genotyper進行基因分型，Linkage軟件計算兩點LOD值，繪制單體型圖。
　　 (2)收集1個Goldenhar綜合征家系中4例患者，2例疑似病人及4例散發(fā)患者的血樣，抽提基因組DNA，然后對EYA1基因編碼蛋白質(zhì)的外顯子3～18進行PCR擴增，用直接雙向測序、Blast對比進行突變分析。
　　 結(jié)果:
　　 (1)未發(fā)現(xiàn)所選微

6、衛(wèi)星位點與該家系疾病表型共分離，LOD值均為負(fù)值。致病基因與已知的14q32區(qū)間不存在連鎖關(guān)系。
　　 (2)8例患者和2名表型正常者有3個已知SNP改變。
　　 結(jié)論:
　　 (1)本Goldenhar綜合征家系單體型分析及連鎖分析證實本家系致病基因不在14q32之間的染色體區(qū)域內(nèi)，提示此類疾病存在遺傳異質(zhì)性。
　　 (2)我們對家系中4例患者、兩名疑似患者及4例散發(fā)患者進行了EYA1基因的突變檢測，未

7、發(fā)現(xiàn)任何和疾病共分離的致病性突變，提示EYA1基因不太可能為這些患者的表型負(fù)責(zé)。說明有新的致病基因有待發(fā)現(xiàn)。
　　 第三部分 Goldenhar綜合征家系致畸基因定位研究
　　 目的:
　　 對收集到的Goldenhar家系進行致病基因定位，從而克隆該家系致病基因，闡明Goldenhar綜合征發(fā)病的分子基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 利用高通量生物Illumina Sentrix Human CNV3

8、70-Quadv3-0芯片進行全基因組掃描，并進行全基因組連鎖分析；選取位于相應(yīng)染色體上的微衛(wèi)星標(biāo)記進行驗證、定位致病基因候選區(qū)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)參數(shù)分析的最大LOD值為1.121(位于15q26.2-q26.3，22q11.1-q11.22)，非參數(shù)分析(病人數(shù)設(shè)為4人)的結(jié)果在多個染色體位點如4p15.32，8p12，12q24.31，15q26.2-q26.3和22q11.1-q11.22等多區(qū)域的LO