火絨草抗乙肝作用及其作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）感染引起的一種威脅公共健康的社會性傳染病，而我國是HBV感染高發(fā)地區(qū)，但至今尚無根治的藥物和方法，因此，加強(qiáng)抗乙肝藥物研制仍是當(dāng)務(wù)之急?，F(xiàn)有抗乙肝藥物主要包括干擾素和核苷類似物，由于存在嚴(yán)重的耐藥性和副作用等問題，限制了患者的選擇。而菊科火絨草屬植物火絨草[Leontopodium leontopodioides(Willd.) Beauv.]作為一種資源豐富的民間草藥，廣泛用于肝炎等各種炎癥性疾病的

2、治療，取得了較好療效。因此，開展火絨草抗肝炎的現(xiàn)代研究具有重要意義。
　　本課題第一部分：在前期研究的基礎(chǔ)上，采用浸提法提取火絨草的主要活性組分，采用凝膠和硅膠層析等手段對提取物進(jìn)行了分離純化，并采用HPLC等手段對提取物進(jìn)行了初步分析。第二部分：選擇其中一種提取物作為研究對象，運(yùn)用HBV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠分別研究其體外和體內(nèi)抗乙肝作用；同時，分析比較了抗乙肝潛在靶點(diǎn)血紅素加氧酶-1（HO-1）在三種不同類型肝細(xì)胞中的差

3、異表達(dá)，并探討了該提取物對HO-1基因表達(dá)的影響。
　　一、火絨草的提取分離及抗乙肝活性研究
　　1．火絨草的提取分離及定量分析
　　選取火絨草干燥藥材，采用甲醇室溫浸提法提取，將提取液濃縮成浸膏，經(jīng)萃取獲得正丁醇部位。該部位通過凝膠和反相硅膠柱層析分離純化，最后分離得到實(shí)驗(yàn)所需的火絨草提取物。采用HPLC方法對該提取物進(jìn)行了分析，同時，采用三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色法測定該提取物的總酚酸含量為10.27％。
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4、．火絨草提取物的抗乙肝活性的研究
　　體外抗HBV作用研究：以轉(zhuǎn)染HBV基因的HepG2.2.15細(xì)胞作為抗HBV體外評價模型，以拉米夫定作為陽性藥物。火絨草提取物作用細(xì)胞3天后，采用酶聯(lián)免疫法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗原（HBsAg和HBeAg）含量變化；給藥6天后除檢測抗原水平外，以熒光定量PCR法檢測HBV-DNA的含量變化。結(jié)果表明，火絨草提取物在給藥3天和6天后顯著降低了細(xì)胞培養(yǎng)上清中 HBsAg和HBeAg水平，但給藥6天后

5、對HBV-DNA水平?jīng)]有顯著性影響。
　　體內(nèi)抗HBV作用研究：以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠作為抗HBV體內(nèi)評價模型。將不同濃度的火絨草提取物連續(xù)灌胃給藥30天后，檢測 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)血清轉(zhuǎn)氨酶（GOT/GPT）水平、抗原（HBsAg和HBeAg）濃度和HBV-DNA滴度變化情況，以及肝組織中HBV-DNA滴度和組織病理學(xué)變化情況。結(jié)果表明，給藥后轉(zhuǎn)基因小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶（GOT/GPT）和抗原（HBsAg和HBeAg）水平顯著下降，血

6、清中 HBV-DNA滴度在大劑量下也顯著下降；但給藥后肝組織HBV-DNA水平無顯著變化，肝組織病理學(xué)檢查無明顯改變。
　　二、火絨草提取物抗乙肝作用機(jī)制的初步研究
　　1． HO-1在三種不同類型肝細(xì)胞中差異表達(dá)的比較研究
　　選取 HL7702、HepG2、HepG2.2.15三種細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對象，采用相對RT-PCR方法檢測三種細(xì)胞中HO-1的mRNA表達(dá)水平差異。結(jié)果表明，以HL7702作為對照，HO-1在H

7、epG2細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而在HepG2.2.15細(xì)胞中HO-1的mRNA水平與HL7702無顯著差異。
　　2．火絨草提取物對HepG2.2.15細(xì)胞HO-1基因表達(dá)的影響
　　以火絨草提取物作為受試藥物，采用相對 RT-PCR檢測給藥6天后對HepG2.2.15細(xì)胞中HO-1基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，火絨草提取物在100μg/mL濃度下能顯著誘導(dǎo)HO-1的基因表達(dá)。提示火絨草提取物的抗HBV作用機(jī)制可能與H