腎康注射液對糖尿病腎病的作用及初步機制研究.pdf

1、研究目的:
　　1、對常用DN大鼠模型的建立方法進行篩選并優(yōu)化,為SKI防治DN藥效學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
　　2、采用大鼠DN模型及體外細胞模型,評價SKI對DN的治療作用并探討其作用機制,為SKI的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　3、對SKI中大黃蒽醌成分進行定性、定量分析為揭示其物效機制及二次開發(fā)提供依據(jù);觀測SKI中主成分(大黃素、大黃酸)對腎小球系膜細胞的作用,明確SKI的功效成分,揭示其可能的作用機制。
　　研

2、究方法:
　　一、DN動物模型的研究
　　(1)采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)I型DN大鼠模型并分別對STZ的使用劑量進行篩選。
　　(2)采用高脂飼料聯(lián)合STZ30 mg/kg體重建立II型DN大鼠模型并分別對高脂飼料使用周期進行探討。
　　(3)采用單側(cè)腎切除或單側(cè)腎結(jié)扎并聯(lián)合STZ30 mg/kg體重建立DN大鼠模型并對腎結(jié)扎與切除兩種方法進行探討。
　　二、SKI對DN大鼠的作用及機制研究

3、r>　　(1)采用腹腔注射STZ65 mg/kg建立SD大鼠I型DN模型及高脂飼料飼養(yǎng)4周并聯(lián)合腹腔注射STZ30 mg/kg建立SD大鼠II型DN模型。將DN模型大鼠隨機分成腎康高劑量組(給予SKI10 mL/kg,2次/d,i.p.);腎康中劑量組(給予SKI5 mL/kg,2次/d,i.p.);腎康低劑量組(給予SKI2.5 mL/kg,2次/d,i.p.);在I型DN大鼠實驗中陽性藥物胰島素組(10 U/kg,2次/天,i.m)

4、,在II型DN大鼠實驗中陽性藥物胰島素組(4 U/kg,2次/天,i.m);模型組(生理鹽水,5 mL/kg,2次/d,i.p.)。設(shè)置正常組給予生理鹽水(5 mL/kg,2次/d,i.p.)。分別于給藥前及給藥后第2、4、8周眼底靜脈叢取血檢測血肌酐、尿素氮、甘油三酯、糖化血紅蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等生化指標(biāo)。第8周,取1 mL血于肝素抗凝管內(nèi),于4℃冷凍離心機2000轉(zhuǎn)/分,離心10 min,后取上清;分別檢測血清中T-S

5、OD、CAT、NO、NOS及MDA;動物處死取腎臟稱重、定點取材實施腎臟組織病理學(xué)檢查。
　　(2)采用高糖(含葡萄糖25 mmol/L)培養(yǎng)腎小球系膜細胞建立DN細胞模型并分為腎康高劑量組(高糖培養(yǎng)基含SKI100 mg/L);腎康中劑量組(高糖培養(yǎng)基含SKI50 mg/L);腎康低劑量組(高糖培養(yǎng)基含SKI25 mg/L)。并設(shè)置低糖組(含葡萄糖5.6 mmol/L)及甘露醇組(低糖培養(yǎng)基+19.6 mmol/L甘露醇)。探討

6、SKI對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞的抑制作用。
　　三、SKI中大黃蒽醌類成分的定性、定量分析及活性研究
　　(1)通過三氯甲烷多次萃取SKI中大黃蒽醌成分進行定性、定量分析,并采用島津LC2010-AT高效液相色譜儀;色譜柱為StamsiL-BP C18(250 mm×4.6,5μm);流動相:A(甲醇)-B(0.2％磷酸水溶液),梯度洗脫0-25 min,A:75%-100%;檢測波長440 nm;柱溫:30℃;流速1 m

7、L/min;進樣量:20μL。
　　(2)高糖(25mmol/L葡糖糖)培養(yǎng)腎小球系膜細胞建立DN細胞模型,分別給予大黃酸(80μmmol/L,40μmmol/L,20μmmol/L)及大黃素(80μmmol/L,40μmmol/L,20μmmol/L);采用MTT、流式細胞術(shù)、透射電鏡和western blot方法,檢測或觀察大黃素和大黃酸分別對系膜細胞增殖、細胞周期和凋亡、細胞結(jié)構(gòu)以及bax、
　　caspase-3、c

8、aspase-6、caspase-8蛋白表達等影響。
　　結(jié)果及結(jié)論:
　　采用腹腔注射STZ65 mg/kg體重建立大鼠I型DN模型,模型成功率高,且對動物損傷小;高脂飼料飼養(yǎng)4周聯(lián)合腹腔注射STZ30 mg/kg體重建立大鼠II型DN模型,周期短,模型成功率高且經(jīng)濟;單側(cè)腎結(jié)扎聯(lián)合腹腔注射STZ30 mg/kg建立DN大鼠模型對動物損傷小,動物死亡率相對較低。
　　SKI各劑量組均明顯降低血肌酐、尿素氮、甘油三酯、

9、低密度脂蛋白的含量(P<0.05);升高DN大鼠血中高密度脂蛋白含量(P<0.05);顯著抑制腎臟肥大(P<0.05)。與模型組比較,SKI顯著升高血清中T-SOD、CAT活力(P<0.05);明顯降低血清中NO、NOS及MDA含量(P<0.05)。腎組織病理學(xué)檢查證實,SKI各劑量組均能明顯改善腎臟損傷,緩解腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。體外研究證實SKI能夠顯著抑制腎小球系膜細胞增殖,促進系膜細胞凋亡,影響系膜細胞周期中DNA合成階段。<

10、br>　　SKI中五種蒽醌類成分的含量順序為蘆薈大黃素>大黃素>大黃酸>大黃酚>大黃素甲醚。通過對三批次含量分析證實蘆薈大黃素的含量為23.20±1.36μg/mL,大黃酸為11.19±2.00μg/mL,大黃素為12.50±2.49μg/mL;大黃酚為7.10±1.49μg/mL;大黃素甲醚為1.51±0.21μg/mL。體外實驗發(fā)現(xiàn)大黃素和大黃酸各濃度組均能明顯抑制高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞增殖,其機制可能與抑制腎小球系膜細胞周期、促