淫羊藿素對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡Foxp3-Il17a調(diào)控作用與分子機(jī)制及其治療MRL-lpr狼瘡鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多器官、多系統(tǒng)受累的自身免疫性疾病。其確切病因及發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚，研究表明，CD4+T細(xì)胞在SLE自身免疫反應(yīng)的啟動(dòng)、維持以及器官損害方面發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞和Th17細(xì)胞作為特殊的T細(xì)胞亞群，其平衡對(duì)維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定意義重大。大量實(shí)驗(yàn)證明，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞失衡與自身免疫性疾病特別是SLE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。<

2、br>　　SLE的治療目前尚無有效根治辦法。盡管恰當(dāng)?shù)膽?yīng)用抗瘧藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑，以及生物制劑可使大多數(shù)患者達(dá)到病情緩解，但是部分患者對(duì)這些藥物不敏感、部分患者容易復(fù)發(fā)，部分患者對(duì)這些藥物的副作用難以耐受。因此，積極探尋新的治療方法、治療藥物刻不容緩。
　　淫羊藿為傳統(tǒng)中草藥，來源于小檗科淫羊藿屬植物。淫羊藿素(icaritin，ICT)是淫羊藿的主要成分淫羊藿苷的體內(nèi)代謝產(chǎn)物。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中淫羊藿是一種補(bǔ)腎壯陽的中藥，而現(xiàn)

3、代藥理研究表明，淫羊藿有效成分及其提取物具有廣泛的生理活性[2]。Zhang等在研究ICT抑制K562細(xì)胞株細(xì)胞增殖的過程中發(fā)現(xiàn)ICT具有下調(diào)雌激素受體活性[3]。Li等發(fā)現(xiàn)ICT能夠抑制T細(xì)胞活化從而延長(zhǎng)老鼠接受皮膚同種異體移植后的壽命[4]。雌激素受體以及T細(xì)胞異?；罨赟LE的發(fā)病過程中起了重要作用[5]。但是ICT對(duì)SLE的治療作用，國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。在此背景下，我們進(jìn)行了體外用ICT作用于SLE CD4+T細(xì)胞以及體內(nèi)治療M

4、RL/lpr狼瘡鼠的探索。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ICT能夠調(diào)控SLE CD4+T細(xì)胞Foxp3/IL17a平衡，增強(qiáng)Treg細(xì)胞抑制功能與抑制CD4+T細(xì)胞過度活化;進(jìn)一步通過表達(dá)譜芯片與siRNA干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ICT引起的轉(zhuǎn)錄因子STAT5b表達(dá)水平升高繼而影響Foxp3/IL17a啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的改變可能是ICT調(diào)控Foxp3/IL17a平衡的機(jī)制之一;體內(nèi)給MRL/lpr狼瘡鼠喂養(yǎng)ICT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ICT能夠降低MRL/lpr狼瘡鼠尿

5、蛋白水平，減少腎臟組織IgG、C3沉積及改善腎臟組織病理損傷。
　　第一部分 ICT對(duì)SLE CD4+T細(xì)胞Foxp3/IL17a的調(diào)控作用
　　第一節(jié) ICT調(diào)控SLE CD4+T細(xì)胞Foxp3與IL17a表達(dá)
　　目的:
　　探討ICT對(duì)SLE CD4+T細(xì)胞Foxp3與IL17a表達(dá)水平的影響。
　　方法:
　　免疫磁珠法分離SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞，用40uM/L ICT刺激CD4+T細(xì)

6、胞72h后，采用Real-time RT-PCR法檢測(cè)Foxp3與IL17a mRNA的表達(dá)水平，western blot檢測(cè)Foxp3蛋白水平，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IL17a蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組相比，ICT組Foxp3 mRNA水平顯著升高（對(duì)照組vsICT處理組:1±0.0 vs2.288±0.3962，P=0.0019）， IL17amRNA水平顯著下降(對(duì)照組vs ICT處理組:1±0

7、.0 vs0.4077±0.1839，P=0.002)。2.與對(duì)照組相比，ICT組Foxp3蛋白水平顯著升高（對(duì)照組 vs ICT處理組:0.6167±0.07638 vs1.46±0.2254，p=0.0036），IL17a蛋白水平下降(對(duì)照組 vs ICT處理組:41.86±12.82 vs30.34±0.7566，P=0.0344)。
　　結(jié)論:
　　ICT能夠增強(qiáng)SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)，降低IL

8、17a分泌。
　　關(guān)鍵詞:淫羊藿素;Foxp3;IL17a;基因表達(dá)
　　第二節(jié) ICT對(duì)SLE Treg細(xì)胞功能與CD4+T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)的影響
　　目的:
　　探討ICT對(duì)SLE Treg細(xì)胞抑制功能與CD4+T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)的影響。
　　方法:
　　免疫磁珠法分離SLE患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞，CD4+CD25-T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD19+B細(xì)胞。使用40u

9、M/L ICT刺激CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞72h后，Treg細(xì)胞與CD4+CD25-T細(xì)胞1∶1共培養(yǎng)5天，采用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)Treg抑制功能，ELISA法檢測(cè)上清中細(xì)胞因子IL10，TGF-β水平。用40uM/L ICT刺激CD4+T細(xì)胞72h后，CD4+T細(xì)胞與自身CD19+B細(xì)胞1∶4共培養(yǎng)8天，收集細(xì)胞與上清，ELISA法檢測(cè)上清中IFN-γ，IL-6，TNF-α水平以及自身B細(xì)胞IgG抗體產(chǎn)量，流式細(xì)胞

10、術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞表面自身免疫分子CD40L，CD70表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組相比，ICT組Treg細(xì)胞抑制功能增強(qiáng)（對(duì)照組vs ICT處理組:33.67±10.97 vs63.1±2.265，p=0.0104），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組和ICT組Treg細(xì)胞體外擴(kuò)增2周后，細(xì)胞數(shù)量無明顯差異。
　　2.與對(duì)照組相比，ICT組IL-10分泌增加（78.19±35.01 vs196.2±38.21，p

11、=0.0039），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TGF-β分泌物無顯著差異（110.2±3.942 vs114.4±5.568，p=0.1626）。
　　3.與對(duì)照組相比，ICT組刺激自身B細(xì)胞IgG抗體產(chǎn)量顯著下降（對(duì)照組vs ICT處理組:43.14±12.52 vs6.476±3.364，p=0.0013），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.與對(duì)照組相比，ICT處理組CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ，IL-6，TNF-α水平降低（對(duì)照組

12、vs ICT處理組:330.6±17.23 vs194.56±6.762，P=0.0252;521.6±61.2 vs251.1±58.9, P=0.0337;750.2±32.753 vs420.6±23.341，p=0.0045），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.與對(duì)照組相比， ICT組CD4+T細(xì)胞表面CD40L，CD70表達(dá)降低（對(duì)照組vs ICT處理組:2±0.1 vs1±0.2，P=0.029;對(duì)照組vsICT處理組:3

13、.6±0.26 vs1.46±0.25，P=0.00378）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　ICT能夠增強(qiáng)Treg抑制功能，抑制CD4+T細(xì)胞過度活化及炎性因子的產(chǎn)生。
　　關(guān)鍵詞:淫羊藿素;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;CD4+T細(xì)胞;細(xì)胞因子
　　第二部分 ICT調(diào)控SLE CD4+T細(xì)胞Foxp3與IL17a表達(dá)的分子機(jī)制
　　第一節(jié) ICT對(duì)Foxp3與IL17a啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的影響
　　目的:

14、r>　　探討淫羊藿對(duì)Foxp3與IL17a啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的影響。
　　方法:
　　采用第一部分第一節(jié)預(yù)留的標(biāo)本，染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)方法結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)法檢測(cè)Foxp3與IL17a啟動(dòng)子區(qū)域H3K4、H3K9三甲基化、H4乙?；?。
　　結(jié)果:
　　與對(duì)照組相比，ICT組SLE患者CD4+T細(xì)胞Foxp3啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3的水平顯著升高(對(duì)照組vs ICT處理組:1

15、±0.0 vs11.1±3.21，P=0.0081);與對(duì)照組相比，ICT組SLE患者CD4+T細(xì)胞IL17a啟動(dòng)子區(qū)H3K9me3的水平顯著升高（對(duì)照組vs ICT處理組:1±0.0vs4.367±1.106，p=0.0341）。對(duì)照組和ICT組Foxp3/IL17a啟動(dòng)子區(qū)H4乙酰化水平無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　ICT通過增強(qiáng)H3K4me3的水平促進(jìn)Foxp3表達(dá)，通過增強(qiáng)H3K9me3的水平降低IL17a表達(dá)。

16、r>　　關(guān)鍵詞:淫羊藿素;H3K4me3;H3K9me3;組蛋白修飾
　　第二節(jié) ICT刺激后SLE CD4+T細(xì)胞全基因組表達(dá)譜分析
　　目的:
　　通過表達(dá)譜芯片了解ICT刺激SLE CD4+T細(xì)胞后基因組表達(dá)水平的影響，并尋找ICT調(diào)控SLE CD4+T細(xì)胞Foxp3與IL17a表達(dá)的潛在靶點(diǎn)。
　　方法:
　　免疫磁珠法分離2例SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞，使用40uM/LICT刺激CD4+T細(xì)胞

17、72h后，收集細(xì)胞、抽提總RNA，Affymetrix表達(dá)譜芯片檢測(cè)全基因組基因表達(dá)差異。采用GO分析以及Pathway分析找到富集差異的GO分類條目與Pathway條目;采用Real-timeRT-PCR法驗(yàn)證挑選出的差異基因。
　　結(jié)果:
　　與對(duì)照組相比，ICT組共檢出3倍以上差異基因1007個(gè)，其中上調(diào)612個(gè)（占差異基因60％），下調(diào)395個(gè)（占差異基因40％）。GO分析以及Pathway分析發(fā)現(xiàn)ICT主要影響免疫

18、反應(yīng)相關(guān)生物過程與信號(hào)通路的改變。挑選出的4個(gè)差異基因(IRF-4，STAT5a，STAT5b，HIF-1)是能夠共同調(diào)控Foxp3/IL17a表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，Real-time RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示這4個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與基因芯片檢測(cè)結(jié)果一致，其中STAT5b顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1±0 vs2.467±0.1508, p=0.0339)。
　　結(jié)論:
　　ICT主要下調(diào)SLE CD4+T細(xì)胞免疫相關(guān)生物過程與信

19、號(hào)通路的基因表達(dá)，其中STAT5b可能是ICT調(diào)控Foxp3/IL17a的潛在靶點(diǎn)。
　　第三節(jié) ICT刺激后STAT5b的改變及其與Foxp3/IL17a的關(guān)系
　　目的:
　　探討干擾STAT5b后，淫羊藿對(duì)Foxp3/IL17a表達(dá)的調(diào)控是否改變。
　　方法:
　　設(shè)計(jì)針對(duì)STAT5的小干擾RNA，電穿孔法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染活動(dòng)性SLE患者的CD4+T細(xì)胞，再予ICT刺激24h。收集細(xì)胞后，用Real-time

20、RT-PCR及Western Blot檢測(cè)STAT5b干擾效果，用Real-time RT-PCR檢測(cè)Foxp3與IL17a mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　干擾STAT5b后，ICT組較對(duì)照組Foxp3改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（1±0 vs1.073±0.07959，p=0.17），IL17a升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1±0vs1.293±0.01839, p=0.18)。
　　結(jié)論:
　　干擾STAT5b后，ICT不能調(diào)

21、控Foxp3/IL17a表達(dá)。
　　關(guān)鍵詞:淫羊藿素;STAT5b;電穿孔;轉(zhuǎn)染
　　第三部分 ICT對(duì)MRL/Ipr狼瘡鼠的治療作用
　　目的:
　　探索ICT對(duì)MRL/lpr狼瘡鼠的治療作用。
　　方法:
　　SPF級(jí)別14周齡雌性MRL/lpr狼瘡鼠20只，隨機(jī)分成2組，其中實(shí)驗(yàn)組10只，對(duì)照組10只。實(shí)驗(yàn)組每天喂養(yǎng)ICT（用羧甲基纖維素制成糊狀），對(duì)照組每天喂養(yǎng)等量溶劑羧甲基纖維素(CMC)。

22、ELISA法檢測(cè)抗dsDNA抗體，IL-10，TGF-β，IFN-γ水平，尿蛋白試紙檢測(cè)尿蛋白水平，直接免疫熒光法檢測(cè)腎臟組織IgG，C3沉積，HE染色檢測(cè)小鼠腎臟損害情況。
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)照組與ICT喂養(yǎng)組MRL/lpr狼瘡鼠抗dsDNA抗體、IL-10，TGF-β，IFN-γ水平比較
　　喂養(yǎng)4周后，即小鼠20周齡時(shí)，ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比， ICT喂養(yǎng)組抗dsDNA抗體分泌降低(67140±48

23、36 vs55080±9596，p=0.0371)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IL-10分泌降低（6441±479.9vs5627±486.6，p=0.0116），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;TGF-β分泌無明顯改變（110.2±3.942 vs114.4±5.568，p=0.1626）;IFN-γ分泌無明顯改變（493.9±25.94 vs497±41.58，p=0.8675）。
　　2.對(duì)照組與ICT喂養(yǎng)組MRL/lpr狼瘡鼠尿蛋白比較

24、r>　　經(jīng)過4周ICT治療后，與對(duì)照組相比，ICT喂養(yǎng)組尿蛋白顯著降低（300±73.02967 vs84.2857±38.72105，P=0.0198），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.對(duì)照組與ICT喂養(yǎng)組MRL/lpr狼瘡鼠腎臟組織免疫熒光IgG，C3沉積
　　IgG，C3直接免疫熒光結(jié)果顯示:ICT喂養(yǎng)組狼瘡鼠腎小球系膜區(qū)著色亮度不清晰，熒光強(qiáng)度較弱，IgG，C3沉積較少;而對(duì)照組狼瘡鼠腎小球系膜區(qū)腎臟著色明顯，亮度耀眼

25、，IgG，C3沉積較多。
　　4.對(duì)照組與ICT喂養(yǎng)組MRL/lpr狼瘡鼠腎臟病理評(píng)分
　　HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ICT喂養(yǎng)組腎臟病理腎小球評(píng)分降低（8.36±1.067 vs6.72±0.7935，p=0.0129），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;腎臟病理腎小管評(píng)分降低(8.16±1.328 vs6.04±1.054，p=0.012)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　ICT對(duì)MRL/lpr狼瘡鼠腎臟損害有