基于同軸電紡技術的rFN-CDH仿生支架體外促MSC成骨分化的實驗研究.pdf

1、由于創(chuàng)傷或先天性原因導致的不可恢復的骨組織損傷及結構改變，每年有大量的患者需要通過骨移植方式進行骨組織再生重建。當前，很多種方法被應用于骨組織修復重建，主要是通過使用自體骨移植（從患者），異體骨移植（從供體）和各種生物材料三種方式進行。自體骨移植一直以來被認為是治療骨缺損的金標準，雖然有成功的案例，但這種技術受到材料可用性的限制。同種異體植骨技術，則可能會引入免疫排斥反應或病原體侵入等副作用。因此尋找可替代的人工骨修復材料成為骨組織修復

2、重建的發(fā)展方向。
　　成功實現(xiàn)組織工程化骨損傷修復包含三個主要因素:具有成骨分化潛能的種子細胞、具有誘導種子細胞向成骨方向分化的生長因子以及支持種子細胞生長的三維立體支架。因此，本課題的目的在于利用同軸靜電紡絲技術，構建能夠緩慢釋放促成骨誘導因子的納米纖維復合支架。為種子細胞提供理想的體外增殖、粘附、分化微環(huán)境，促進體外組織工程化骨損傷修復。為組織工程化骨損傷修復的研究提供新的思路。
　　方法:
　　1.不同rFN/C

3、DH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的制備
　　基于課題組的前期工作，課題組成員張瑗博士合成的rFN/CDH11蛋白的融合基因，利用pET22b作為基因載體，以Rosetta-gamiTM i(DE3)為感受態(tài)細胞，表達和純化得到的rFN/CDH11蛋白質。采用同軸靜電紡絲技術，構建含有聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、Ⅰ型膠原蛋白，以及不同濃度的重組纖維連接蛋白/鈣粘附蛋白(0μg/ml、1.0μg/ml、10

4、.0μg/ml、50.0μg/ml、100.0μg/ml)的仿生納米骨支架。
　　2.不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的表征評價
　　利用傅立葉紅外光譜儀(FTIR)、X線光電子能譜(XPS)、掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)以及高效液相色譜分析(HPLC)等方法，了解骨支架的化學元素的組成、表面微觀結構，納米纖維的微觀結構以及rFN/CDH11蛋白的釋放效率;接觸角分析(Contact Angle)與生

5、物力學分析法用于測定納米骨支架的親/疏水性與抗拉強度、彈性模量。通過評價仿生骨納米支架的生物理化性質，判斷能否與組織相容。
　　3.不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的體外功能學研究
　　以入骨髓間充質干細胞(hMSCs)為種子細胞，通過掃描電鏡法觀察hMSCs在骨支架表面增殖、粘附、形態(tài)的情況;MTT法檢測細胞增殖與支架的對細胞的毒性作用;實時定量PCR(qRT-PCR)法檢測ALPL基因、OCN基因、RUNX

6、2基因的表達情況。
　　結果:
　　1.不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的制備
　　按照最適宜的同軸電紡參數條件（V=16-18Kv，v內=v外=0.4-0.7ml/h，d=15cm），成功制備不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架若干張。
　　2.不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的表征評價
　　(1)SEM觀察骨支架表面形態(tài)均勻，納米纖維連續(xù)性較好，無串珠樣纖維存在，直

7、徑分布均勻。Image J軟件測量結果顯示骨支架的纖維直徑與加入的rFN/CDH11蛋白成反比。(2)TEM觀察了單根同軸納米纖維的內部微觀結構，為具有相同軸心的殼-核結構。(3)XPS數據顯示133.0 eV、164.0eV、190.0 eV以及401.0eV峰譜，即硫(S)、磷(P)、氮元素(N)，說明Ⅰ型膠原蛋白與rFN/CDH11蛋白已經被紡入同軸纖維內。(4)FTIR結果表明，同軸電紡過程中沒有產生新的化學基團產生，同軸纖維具

8、各材料的優(yōu)勢性能。(5)孔隙率測定表明骨支架中的孔隙率介于67-76％之間，其大小與rFN/CDH11蛋白濃度成正比。(6)接觸角測試說明骨支架中含rFN/CDH11蛋白濃度越大，支架的親水性越好。(7)力學測試結果顯示骨支架的承受的抗拉強度及彈性模量與支架中的rFN/CDH11蛋白濃度成正比。(8)蛋白釋放檢測顯示出蛋白質早期的“爆發(fā)性釋放”及后續(xù)的緩釋效果，實現(xiàn)了蛋白的可控緩慢釋放。通過以上表征評價，50μg/ml及100μg/ml

9、濃度的rFN/CDH11蛋白骨支架具有較好的理化性質。
　　3.不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的體外功能學研究
　　(1)SEM觀察hMSCs在接種到支架上培養(yǎng)3天、7天后的細胞形態(tài):3天組中50μg/ml蛋白濃度組的細胞生長狀態(tài)最好，成嵌入式生長在支架表面，粘稠物質可能是分泌型成骨細胞分泌的細胞外基質。7天組，各個蛋白濃度組之間未見明顯差異(2) MTT法檢測支架的促細胞粘附作用:hMSCs細胞接種0.5h

10、，1h，2h三個時間點內，50μg/ml蛋白濃度組的OD值均最大且明顯高于陰性對照組(p＜0.05)。(3) MTT法檢測骨支架促細胞增殖作用:hMSCs細胞接種2、4、6、8天四個時間點內，50μg/ml蛋白濃度組的OD值均最大且明顯高于陰性對照組(p＜0.05)。(4)實時定量PCR法測試誘導成骨標志基因的結果顯示:hMSCs細胞接種1、2、3周內，50μg/ml蛋白濃度組與陰性對照組的RQ值倍數均最大且明顯高于陰性對照組(p＜0.

11、05);1周時，RUNX2基因表達最高，ALPL基因次之;2周時，OCN基因及ALPL基因表達升高，RUNX2基因表達相對下降;3周時RUNX2基因表達再次升高。通過以上細胞學實驗研究，50μg/ml蛋白濃度的rFN/CDH11蛋白骨支架具有最佳的促hMSCs粘附、增殖、分化的作用。
　　結論:
　　1.本課題組前期工作中發(fā)現(xiàn)rFN/CDH11融合蛋白具有良好的促hMSCs細胞粘附、增殖及向成骨細胞方向分化的能力，結合同軸靜

12、電紡絲特有的殼-核結構，較好的實現(xiàn)了rFN/CDH11蛋白的緩釋作用，持續(xù)而緩慢的作用于種子細胞。
　　2.同軸靜電紡絲法構建的含有rFN/CDH11蛋白的納米纖維骨支架是由獨特的殼-核結構，直徑分布為400-800nm的纖維通過無序的排列形成，微觀結構類似于細胞外基質的空間結構。
　　3.同軸靜電紡絲法構建的含有rFN/CDH11蛋白的納米纖維骨支架具有良好的親水性、抗拉強度、化學組成以及優(yōu)良的可降解性，是一種能與細胞相容

13、的仿生骨組織工程支架。
　　4.不同rFN/CDH11蛋白濃度的同軸靜電紡絲法構建的納米纖維骨支架均促進了hMSCs體外增殖、粘附作用，hMSCs經成骨誘導分化后，成骨標志物基因如ALPL基因、OCN基因、RUNX2基因的表達上調。其中50μg/ml rFN/CDH11蛋白濃度的骨支架較其他4個濃度的納米纖維骨支架而言，成骨標志基因表達顯著上調。
　　5.50μg/ml rFN/CDH11蛋白濃度的同軸靜電紡絲納米纖維骨支架