骨髓間充質干細胞膜片復合Col-Ⅰ支架人工骨的體外成骨分化研究.pdf

1、外傷、炎癥、腫瘤切除及先天畸形造成的骨缺損是一類常見而復雜的疾病，嚴重影響患者生存質量。目前臨床仍以自體骨移植作為骨缺損修復的金標準，但因供體缺乏，供區(qū)損傷而使臨床應用受限。學者們試圖尋找可以和自體骨的成骨性能相媲美的人工骨修復材料。理想的人工材料修復骨缺損過程是生物支架材料在體內逐漸降解吸收的同時種子細胞不斷增殖分化，最終形成新的骨組織。傳統(tǒng)方法中收獲種子細胞時使用的胰蛋白酶會破壞種子細胞的細胞外基質及細胞間連接蛋白，影響細胞活性。接

2、種到多孔支架材料中的一部分細胞會因未與支架材料貼附而流失。而新技術細胞膜片技術(cell sheet technology, CST)[1]可收獲完整的細胞膜片，保留了細胞自分泌的細胞外基質以及一些重要的細胞表面蛋白如離子通道、生長因子受體等，并且減少了細胞流失。目前細胞膜片技術已成功應用于構建心肌、角膜、食管上皮、牙周韌帶[2，3]等，但是在骨組織修復中的應用尚不明確。
　　骨髓間充質干細胞(BMSCs)容易分離獲取，有良好的自

3、我更新及成骨分化潛力，是骨缺損修復的理想種子細胞。理想的支架材料應具有生物相容性、可降解性、骨傳導性、骨誘導性，無免疫排斥反應，植入骨缺損處后可逐漸降解，最終被新生成的骨組織取代。Col-Ⅰ是骨基質的主要成分，其疏松多孔結構有利于細胞的粘附植入，且具有成骨誘導作用，是理想的骨修復支架材料。
　　目的:
　　本研究通過細胞膜片技術構建出骨髓間充質干細胞膜片并復合Col-Ⅰ支架制成生物材料人工骨，并與散在細胞復合支架構建的生物材

4、料人工骨進行體外成骨分化能力的比較，探討細胞膜片技術在骨缺損修復中的優(yōu)勢。
　　方法:
　　制備納米級多孔Col-Ⅰ支架，通過高密度連續(xù)培養(yǎng)及機械吹落的方法獲得包含多層骨髓間充質干細胞的細胞膜片，將骨髓間充質干細胞膜片及散在骨髓間充質干細胞分別結合Col-Ⅰ支架材料，培養(yǎng)于成骨誘導液，于不同時間點比較兩者成骨分化標志物的表達，包括堿性磷酸酶(ALP)活性、骨橋蛋白(OPN)表達量以及鈣結節(jié)的形成量，綜合評價兩者的成骨分化能力

5、。
　　結果:
　　1.ALP活性:細胞結合支架后第3天和第7天，細胞膜片組(47.03±6.37 U/L，22.61±1.95 U/L)比散在細胞組(34.58±2.43 U/L，16.28±104 U/L)有更高的ALP活性(P＜0.05)。
　　2.OPN蛋白表達:細胞結合支架后第7、14、21、28天，細胞膜片組(1113.1±27.5ng/ml,966.5±95.2 ng/ml,1173.2±111.6 ng

6、/ml,1157.6±47.4 ng/ml)比散在細胞組（943.5±18 ng/ml，735.8±101.7 ng/ml，1133.6±89.8 ng/ml，1077.2±137.6ng/ml）有更大的OPN蛋白表達量(P＜0.05)。
　　3.鈣結節(jié)形成量:細胞結合支架后第28天，掃描電鏡可見細胞膜片組鈣結節(jié)形成的密度明顯高于散在細胞組。X射線能譜分析結果顯示礦化結節(jié)主要由鈣、磷、碳、氧四種元素構成，細胞膜片組鈣元素含量(0.