rFN-CDH仿生界面促進(jìn)體外成骨性粘附分化和體內(nèi)骨融合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、當(dāng)前,組織工程學(xué)的突破進(jìn)展為研發(fā)具有應(yīng)用價(jià)值的骨修復(fù)材料賦予了極大啟示,而多樣化的骨替代材料在系列研究中亦表現(xiàn)出極高的潛在價(jià)值,但在應(yīng)用中往往并不具備實(shí)際意義,即其修復(fù)能力仍難達(dá)到臨床需求。從表象上來(lái)講,主要?dú)w因于材料本身(如金屬、多聚物、生物陶瓷)特性單一,不足以提供骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)雙重信號(hào)。然而,本課題組認(rèn)為:只有充分認(rèn)識(shí)到材料-組織整合過(guò)程中的分子機(jī)制和細(xì)胞作用,才能從根本上解決如上科學(xué)問(wèn)題。
　　 骨整合(osteoint

2、egration)信號(hào)傳遞到材料-組織界面有兩個(gè)關(guān)鍵因素:1.要有足夠數(shù)量的細(xì)胞與生物分子充分作用以啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào);2.生物信號(hào)的活性,強(qiáng)度必須高于細(xì)胞活性的刺激閾值。從這一要求出發(fā),本課題旨在通過(guò)雙嗜性分子重組纖維連接蛋白/鈣粘附蛋白(recombinant fibronectin/cadherin chimera,rFN/CDFI)仿生修飾骨支架材料,構(gòu)建具有優(yōu)良生物理化特征的仿生學(xué)界面和適宜骨種子細(xì)胞粘附、增殖和分化的微環(huán)境。通過(guò)提

3、高種子細(xì)胞在界面的粘附效率和生長(zhǎng)信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)而增強(qiáng)組織工程化材料在體內(nèi)外的骨修復(fù)能力,從而有效解決傳統(tǒng)組織工程材料粘附效率低和成骨信號(hào)弱的問(wèn)題。
　　 方法:
　　 1.rFN/CDH融合蛋白的構(gòu)建設(shè)計(jì)、基因克隆和蛋白表達(dá)純化
　　 以FN和CDH11作為前體分子,生物信息學(xué)分析以了解其結(jié)構(gòu)序列與功能基團(tuán)。采用“同源模建”作為分子模擬策略確定FN和CDH11功能片段的接合方式。常規(guī)PCR擴(kuò)增FNⅢ7-10和CDH

4、11 EC1-2基因片段后應(yīng)用重疊延伸PCR(Splice-over-extensionPCR,SOE-PCR)進(jìn)行基因拼接。將此融合基因插入原核表達(dá)載體pET-22b進(jìn)而構(gòu)建重組載體。重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Rsoetta-gami(DE3),優(yōu)化參數(shù)實(shí)現(xiàn)rFN/CDH的誘導(dǎo)表達(dá),金屬離子層析純化蛋白。免疫印跡和生物質(zhì)譜分析確定融合蛋白種屬。離心促粘附實(shí)驗(yàn)和成骨誘導(dǎo)驗(yàn)證rFN/CDH體外生物活性。
　　 2.rFN/CDH-BCP

5、仿生界面的組裝策略與表征評(píng)價(jià)
　　 DTBP同雙官交聯(lián)法將rFN/CDH以共價(jià)方式接合在雙相鈣磷陶瓷(Biphasiccalcium phosphate ceramic,BCP)表面構(gòu)建仿生界面。掃描電鏡法(Scanningelectro-microscopy,SEM)、X光電子能譜法(X ray photoelectron spectroscopy,XPS)、接觸角分析和蛋白吸附實(shí)驗(yàn)分別了解仿生修飾對(duì)材料表面微觀結(jié)構(gòu)、化學(xué)元素

6、組成和分布、親/疏水性、rFN/CDH分布密度的影響,初步評(píng)價(jià)rFN/CDH-BCP仿生界面的組織相容性。
　　 3.體外功能學(xué)與機(jī)制研究:rFN/CDH-BCP仿生界面對(duì)骨種子細(xì)胞增殖、粘附和分化的影響
　　 以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human Mesenchymal stem cells,hMSCs)為骨種子細(xì)胞,采用離心促粘附實(shí)驗(yàn)、MTT法和SEM觀察rFN/CDH-BCP仿生界面對(duì)細(xì)胞粘附、增殖、形態(tài)的影響。同時(shí),

7、以堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)作為成骨分化的早、晚期指標(biāo),分光比色法觀察成骨誘導(dǎo)后hMSCs的ALP酶活性,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time RT PCR)和免疫印跡(western blotting)法檢測(cè)OCN基因和蛋白表達(dá),茜素紅染色法鑒定鈣結(jié)節(jié)形成情況。以此綜合判斷rFN/CDH-BCP仿生界面對(duì)hMSCs成骨分化的影響。進(jìn)一步采用粘附斑激酶(Fo

8、cal adhesion kinase,FAK)397酪氨酸磷酸化(phosphorylation of Tyrosine397,pY397)特異性抗體封閉hMSCs表面作用位點(diǎn),初步探討FAK pY397與rFN/CDH-BCP介導(dǎo)的細(xì)胞粘附和分化間的關(guān)系。
　　 4.體內(nèi)功能研究:復(fù)合bMSCs的rFN/CDH-BCP組織工程骨的體內(nèi)成骨效應(yīng)
　　 以兔MSCs(bMSCs)為種子細(xì)胞構(gòu)建rFN/CDH-BCP組織工

9、程化人工骨,將其植入兔腰椎橫突5-6間行融合術(shù)。影像學(xué)手段(X片和CT三維重建)觀察骨愈合情況;三點(diǎn)抗彎實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腰椎融合部位力學(xué)強(qiáng)度;HE、Masson和甲苯胺藍(lán)染色法觀察材料-組織間的骨整合狀況。
　　 結(jié)果:
　　 1.rFN/CDH融合蛋白的構(gòu)建設(shè)計(jì)、基因克隆和蛋白表達(dá)純化
　　 確定CDH11 EC1-2-(Ser)3-FNⅢ7-10是適宜融合蛋白構(gòu)建的接合方式,生物信息學(xué)分析提示改良大腸桿菌系統(tǒng)適合融合

10、蛋白優(yōu)化表達(dá)。采用SOE-PCR將0.8kbp的CDH11 EC1-2和1.1kbp的FNⅢ7-10片段成功拼接為1.9kbp的融合基因,雙酶切實(shí)驗(yàn)和DNA測(cè)序證實(shí)重組載體構(gòu)建成功、準(zhǔn)確。轉(zhuǎn)化Rosetta-gami(DE3)后于IPTG終濃度0.4mM,重組菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)值0.5-0.6,誘導(dǎo)溫度30℃,誘導(dǎo)時(shí)間4-6hr的條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)rFN/CDH(75 kDa)的高效、可溶性表達(dá)。6×His標(biāo)簽行鎳柱(Ni-NTA)吸附純化后純度大于

11、96％。質(zhì)譜分析確認(rèn)rFN/CDH種屬完全正確,屬于一種FN前體分子和一種CDH11前體分子。離心促粘附實(shí)驗(yàn)表明rFN/CDH涂層的TCPS表面對(duì)成骨細(xì)胞株MC3T3-E1的吸附作用明顯強(qiáng)于單純FN和CDH(1.4倍和2.9倍,p＜0.05)。成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示rFN/CDH促進(jìn)ALP活性升高和OCN基因表達(dá)上調(diào),顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照(p＜0.05)。
　　 2.rFN/CDH-BCP仿生界面的組裝策略與表征評(píng)價(jià)
　　 XPS

12、數(shù)據(jù)顯示仿生修飾后BCP表面分別獨(dú)立出現(xiàn)164.0eV和401.0eV的峰譜,即硫和氮元素的分布,提示界面構(gòu)建成功、有效。SEM顯示BCP表面呈巨孔/微孔不規(guī)律分布,且仿生修飾對(duì)微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。XPS表明BCP表面分布有C、O、P、Ca四種元素,而仿生修飾后N元素出現(xiàn),并發(fā)生了C元素的價(jià)態(tài)變化(Cc-N)。且元素含量變化為C、N含量增加而P、Ca含量降低(p＜0.05)。接觸角測(cè)定表明θ角顯著減小(45°→31°,p＜0.05),提示

13、rFN/CDH-BCP界面親水性增加。蛋白吸附實(shí)驗(yàn)提示BCP對(duì)rFN/CDH的吸附在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性,且rFN/CDH的飽和工作濃度為5μg/ml,分布密度為1700 fmol/cm2。
　　 3.體外功能學(xué)與機(jī)制研究:rFN/CDH-BCP仿生界面對(duì)骨種子細(xì)胞增殖、粘附和分化的影響
　　 hMSCs在rFN/CDH-BCP界面上培養(yǎng)1-9天,其增殖率在前期(1-5天)明顯高于陰性和陽(yáng)性對(duì)照組(p＜0.01,p＜0

14、.05)。SEM發(fā)現(xiàn)觀察rFN/CDH修飾BCP界面更利于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng),表現(xiàn)為hMSCs充分伸展為多邊形狀或圓盤狀,偽足樣結(jié)構(gòu)減少。離心粘附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hMSCs在rFN/CDH-BCP表面的粘附數(shù)量與生物配基密度表現(xiàn)為正相關(guān),在1500 fmol/cm2的表面密度下是陽(yáng)性對(duì)照的的4.9倍和1.52倍(p＜0.05)。此結(jié)果提示:rFN/CDH-BCP界面具有極佳的生物相容性,hMSCs在其表面表現(xiàn)出優(yōu)越的粘附、增殖和生長(zhǎng)狀態(tài)。
　

15、　 hMSCs成骨誘導(dǎo)10天后,在rFN/CDH-BCP表面的ALP活性表現(xiàn)最高(約57μmolnitrophenol/min/mg protein,p＜0.05)。成骨誘導(dǎo)14天后,在rFN/CDH-BCP表面的OCN基因和蛋白表達(dá)水平亦為最高(p＜0.05,p＜0.05)。成骨誘導(dǎo)21天后,rFN/CDH-BCP表面的細(xì)胞間形成的橢圓形橘紅色結(jié)節(jié)在數(shù)量和面積上分布最多。此結(jié)果表明:仿生修飾界面可更高效地促進(jìn)hMSCs的成骨分化。<

16、br>　　 利用FAK pY397特異性抗體來(lái)封閉hMSCs表面的信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)如上指標(biāo)均受一定程度的抑制,但并非完全性阻斷,此結(jié)果提示該仿生界面發(fā)揮功能不完全依賴于FAK酪氨酸397的磷酸化,尚有其他磷酸化位點(diǎn)或信號(hào)分子參與該過(guò)程。
　　 4.體內(nèi)功能研究
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究設(shè)計(jì)、制備的rFN/CDH嵌合式融合蛋白實(shí)現(xiàn)了對(duì)FN和CDH11功能學(xué)的疊加,體外具有良好的促粘和成骨活性。
　　

17、2.rFN/CDH生物配基共價(jià)交聯(lián)生物陶瓷BCP界面后具備優(yōu)良的粗糙度、微結(jié)構(gòu)、親水性、化學(xué)組成和可控的配基密度等生物理化特征,是一種生物相容性界面。
　　 3.rFN/CDH-BCP仿生界面在體外有效增強(qiáng)hMSCs的粘附、增殖效率和生長(zhǎng)活力,顯著上調(diào)了干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后ALP、OCN等成骨標(biāo)志物的表達(dá),明顯促進(jìn)了鈣結(jié)節(jié)形成和基質(zhì)礦化能力。
　　 4.特異性ITG-FAK pY397通路在rFN/CDH-BCP介導(dǎo)的干細(xì)胞

18、粘附和分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,FAK pY397可能是rFN/CDH-BCP發(fā)揮生物效應(yīng)的調(diào)節(jié)位點(diǎn)。
　　 5.rFN/CDH-BCP用以兔腰5-6橫突間融合具有優(yōu)良的促進(jìn)骨愈合的能力,具有臨床效果的影像學(xué)征象、力學(xué)整合意義的抗壓強(qiáng)度和生物學(xué)整合意義的組織學(xué)表現(xiàn),具有一定的替代意義。
　　 6.rFN/CDH-BCP具備良好的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)特性,是一種有光明應(yīng)用前景的新型組織工程來(lái)源的骨替代材料,可用于非負(fù)重部位的骨修