SLE患者骨髓MSC成骨分化信號通路研究.pdf

1、成人的骨代謝是骨形成和骨破壞的動態(tài)平衡的過程。目前研究認(rèn)為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者腫瘤壞死因子(TNF)-α為主的炎癥因子介導(dǎo)的破骨細胞過度增殖、活化和成熟是導(dǎo)致SLE患者骨質(zhì)疏松的主要原因,但尚缺乏SLE患者成骨細胞狀態(tài)的研究。成骨細胞來源于骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs),TNF-α對正常人BMMSCs的作用目前仍存在爭議:在體外可能通過活化NF-κB或其他信號通路抑制或活化骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)誘導(dǎo)的問充質(zhì)干細胞(M

2、SCs)向成骨細胞分化,亦有報道在體外對MSCs的成骨分化起抑制作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)SLE患者BMMSCs在普通成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中成骨分化能力下降,推測SLE患者TNF-α可能通過活化NF-κB或其他途徑抑制BMMSCs的BMP/Smad信號通路從而參與骨質(zhì)疏松的病理過程。
　　 多個信號通路包括BMP、Wnt、Notch等參與了BMMSCs的成骨分化的調(diào)節(jié),為研究SLE患者BMMSCs參與成骨的信號通路,我們分離了培養(yǎng)了4

3、例SLE患者和4例健康對照者的BMMSCs,提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,每張芯片以Cy3標(biāo)記的樣本cDNA作為探針,Cy5標(biāo)記的人標(biāo)準(zhǔn)品cDNA作為探針,在表達譜芯片上進行雜交,將SLE患者BMMSCs2萬余基因與正常相比進行比較,并利用qRT-PCR、Westernblot及免疫組化對芯片的結(jié)果和TGF-β、MAPK及細胞周期蛋白調(diào)控信號通路的差異蛋白進行驗證。結(jié)果按差異顯著性篩選出SLEBMMSCs差異基因1905個,其中上調(diào)的6

4、52個,下調(diào)的有1253個;基因本體論(Go)分析顯示,差異基因主要表現(xiàn)于細胞周期和蛋白粘附功能;信號通路(Pathway)分析顯示,差異明顯的信號通路主要為細胞微絲骨架、局部粘附、緊密連接和TGF-β/BMP信號通路。SLEBMMSCsBMP/TGF-β信號通路異常、細胞周期蛋白E(CyelinE)的蛋白表達減少、MAPK/Junk、MAPK/ERK信號通路較正?；罨６诳商街腂MP信號通路的25個基因中,差異表達基因19個,除B

5、MP-5上調(diào)外,其余18個基因均下調(diào),提示該通路處于抑制狀態(tài)。
　　 BMP信號通路的信號通過其受體磷酸化Smadl/5/8蛋白,并與Smad4形成復(fù)合物入核,啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。為研究SLE患者BMMSCsBMP信號通路狀況,用Westernblot方法驗證了SLEBMMSCsBMP/Smad信號通路的蛋白的功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn):SLEBMMSCsBMP受體BMPRIA與正常無異,但磷酸化的Smadl/5/8(pSmadl/5/8)

6、低于正常,Smadl/5/8與Smad4形成的入核復(fù)合物較正常減少。以上證實SLEBMMSCs的BMP/Smad通路處于抑制狀態(tài)。
　　 為研究SLE患者BMMSCsBMP-2誘導(dǎo)成骨分化情況,將細胞在含BMP-2的成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng),檢測其成骨基因堿性磷酸酶(ALP)及成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Rux2的表達及細胞外礦化情況。結(jié)果顯示:SLE患者BMMSCsBMP-2誘導(dǎo)下48小時ALP及Rux2表達、14天ALP活性及21天細胞外基

7、質(zhì)礦化均低于正常,提示其成骨能力下降。
　　 為研究TNF-α對BMMSCs成骨分化的影響,用TNF-α處理BMP-2誘導(dǎo)下的正常人BMMSCs,發(fā)現(xiàn)TNF-α可活化NF-κB信號通路,表現(xiàn)為IκB的減少;同時TNF-α可抑制BMP-2誘導(dǎo)的Smadl/5/8的磷酸化;而NF-κB的抑制劑PDTC可拮抗TNF-α誘導(dǎo)的Smadl/5/8的磷酸化:TNF-α作用48小時可抑制BMP-2誘導(dǎo)下的正常人BMMSCs的ALP及Rux2表

8、達;作用21天可減少細胞外鈣鹽沉積。
　　 進一步研究顯示,SLEBMMSCsNF-κB信號通路中pIκB增多,而IκB減少,提示該通路處于活化狀態(tài);進而,用NF-κB的抑制劑PDTC處理SLE患者的BMMSCs,細胞pSmadl/5/8增加、BMP-2誘導(dǎo)下48小時ALP及Rux2表達及21天細胞外基質(zhì)礦化均部分恢復(fù)。
　　 通過以上研究,可以做出以下結(jié)論:SLE患者BMMSCsBMP/Smad信號通路處于抑制狀態(tài)而N