基于氧化石墨烯和納米金的高靈敏度免疫檢測(cè)新方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)是規(guī)模化發(fā)現(xiàn)和高通量驗(yàn)證,目前依賴于質(zhì)譜技術(shù)的規(guī)?；l(fā)現(xiàn)技術(shù)已獲得到較快的發(fā)展,但是藉此確定的目標(biāo)蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確驗(yàn)證仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的課題?，F(xiàn)有的驗(yàn)證方法主要是基于質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜方法(multiple reaction monitoring,MRM)和基于抗體的免疫檢測(cè)方法。MRM方法雖然具有較好的規(guī)?；芰?但是其靈敏度較低,因而其應(yīng)用受到限制,所以免疫檢測(cè)方法仍是目前首選的方法。免疫檢測(cè)方法的靈敏度相

2、對(duì)較高,但是該方法需要依賴昂貴的抗體,且對(duì)于低豐度蛋白質(zhì),其靈敏度仍不能滿足要求,迫切需要新的靈敏度高、價(jià)格低廉的免疫檢測(cè)方法。
　　針對(duì)以上問(wèn)題,本研究將納米金(GNP)和氧化石墨烯(GO)引入到目前常用的免疫檢測(cè)方法,即蛋白質(zhì)免疫印跡(western blotting)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)中,發(fā)展了新的免疫檢測(cè)方法。其主要原理是基于這兩種納米載體

3、擁有大的比表面積,可以逐級(jí)放大檢測(cè)信號(hào),同時(shí)雙一抗的引入和增大辣根過(guò)氧化物酶(HRP)與二抗的比例等,在提高靈敏度的同時(shí),大大降低了成本。
　　基于以上原理,發(fā)展了新的免疫檢測(cè)方法,包括:基于氧化石墨烯和納米金的信號(hào)雙重放大western blotting新方法和基于氧化石墨烯和納米金的信號(hào)三重放大ELISA新方法。
　　在基于氧化石墨烯和納米金的信號(hào)雙重放大western blotting新方法的研究中,同時(shí)引入了納米金和

4、氧化石墨烯。首先用納米金與一抗結(jié)合,使得一定量的抗原能夠間接地與更多的一抗相結(jié)合,擴(kuò)大了一抗與抗原的比例。然后用氧化石墨烯與二抗結(jié)合,使得一定量的一抗能夠結(jié)合更多的二抗,增大了二抗與一抗的比例。通過(guò)兩次比例的擴(kuò)增,信號(hào)得到逐級(jí)放大,檢測(cè)限被大大降低。而在納米金與一抗結(jié)合過(guò)程中,同時(shí)引入兩種一抗(與抗原對(duì)應(yīng)的特異性一抗和輔助一抗),由于輔助一抗在價(jià)格上比特異性一抗更低廉,所以通過(guò)該步驟操作,在放大信號(hào)的同時(shí),使昂貴的特異性一抗成本大大降低

5、。western blotting新方法的優(yōu)點(diǎn)是在檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行雙重放大的同時(shí)使得成本大大降低,拓寬了傳統(tǒng)western blotting方法的應(yīng)用范圍,增強(qiáng)了檢測(cè)能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,改進(jìn)后的western blotting和傳統(tǒng)Western blotting方法對(duì)GST蛋白質(zhì)的檢測(cè)限分別為2ngmL-1和64ngmL-1,新方法的檢測(cè)限降低了32倍,成本也大大降低。而且多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法穩(wěn)定性好。
　　在基于氧化石墨烯

6、和納米金的信號(hào)三重放大ELISA新方法的研究中,分三次先后引入了納米金、氧化石墨烯和納米金。首先將納米金與雙一抗按一定比例結(jié)合,通過(guò)此步操作,實(shí)現(xiàn)信號(hào)的第一次放大和成本的第一次降低;其次,通過(guò)納米金與二抗和高比例的HRP結(jié)合(此處加入的HRP與二抗的比例是100:1),實(shí)現(xiàn)信號(hào)的第二次放大和成本的第二次降低。最后,將氧化石墨烯與第二步中制備的中間體結(jié)合,擴(kuò)大了二抗與一抗的結(jié)合比例,達(dá)到了再次放大信號(hào)的目的。這種依次將納米金、氧化石墨烯和