氧化石墨烯固定化酶與固定化受體富集的新方法研究.pdf

1、氧化石墨烯（Graphene oxide, GO）作為單原子層碳材料，因其超大的比表面積、良好的生物相容性和親水性等特性吸引了越來(lái)越多的關(guān)注。氧化石墨烯表面具有多種活性含氧官能團(tuán)，如羥基（-OH）、羧基（-COOH）等，適于表面的功能化修飾，可以與其他有機(jī)材料反應(yīng)制備復(fù)合材料，特別是在固定化蛋白方面具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，受限于官能團(tuán)較少等缺點(diǎn)，氧化石墨烯固定化蛋白的負(fù)載能力和可接近性尚待進(jìn)一步提高。
　　表面引發(fā)的原子轉(zhuǎn)移自由

2、基聚合（SI-ATRP）指的是在具有活性基團(tuán)的基底表面，以簡(jiǎn)單的有機(jī)鹵化物為引發(fā)劑、過渡金屬配合物為鹵原子載體，通過氧化還原反應(yīng)，在活性種與休眠種之間建立可逆的動(dòng)態(tài)平衡，從而實(shí)現(xiàn)可控的聚合反應(yīng)。SI-ATRP是受控自由基聚合（CRP）中最有效和最廣泛使用的方法之一。相比將長(zhǎng)鏈聚合物接枝在基質(zhì)上，SI-ATRP首先將引發(fā)劑固定到基底材料表面上，接著在原位引發(fā)并延長(zhǎng)聚合物鏈,因此在載體表面接枝的聚合鏈數(shù)量明顯高于直接連接，并可有效控制接枝聚

3、合物鏈的三維空間結(jié)構(gòu)、厚度及接枝密度。SI-ATRP在工業(yè)中已經(jīng)應(yīng)用于多種聚合方法，目前正在研究用于醫(yī)療和環(huán)境領(lǐng)域。SI-ATRP可以相對(duì)簡(jiǎn)單的方法形成聚合物，通過將單體以受控的、逐件（piece-by-piece）的方式組合在一起，通過這種方法，可以簡(jiǎn)單且穩(wěn)固地將聚合物刷接枝到被引發(fā)的固定表面上。SI-ATRP可以制備不同分子量和分子類型的聚合物，范圍廣泛，并可針對(duì)具有高價(jià)值應(yīng)用的特定性質(zhì)位點(diǎn)特異地定制功能。
　　鑒上，我們?cè)诖?/p>

4、提出一種新的固定化蛋白方法，通過SI-ATRP在GO上進(jìn)行原位聚合物接枝，制備線性聚合物刷雜化GO，進(jìn)而在接枝聚合物上固化蛋白（以胰蛋白酶與HER-2受體為示范分子），以提高其負(fù)載能力，并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)的驗(yàn)證。
　　本研究主要包括兩部分：
　　第一部分：基于GO的固定化酶的制備以及酶切效率的研究
　　基于質(zhì)譜法的“自下而上”（Bottom-up）策略是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最廣泛使用方法，這種方法使用蛋白酶將蛋白質(zhì)樣品消化

5、成肽段混合物，然后通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）鑒定肽段混合物樣品，接著在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)，最終獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息。在該策略中，蛋白質(zhì)的定量和定性信息是來(lái)源于分析鑒定蛋白質(zhì)酶解后的肽段產(chǎn)物得到的。因此，蛋白質(zhì)的酶解消化成為這種研究策略中的關(guān)鍵步驟。
　　與傳統(tǒng)的基于溶液的游離蛋白酶消化低效耗時(shí)相比，固定化蛋白酶為快速高效的消化提供了一個(gè)有前景的替代方案，這種方法可明顯提高樣品處理量。在本研究中，我們開發(fā)出了一種

6、新的固定化蛋白酶消化策略，即在GO表面接枝兩種不同聚合物，并在其上固定胰蛋白酶。使用SI-ATRP反應(yīng)在氧化石墨烯表面接枝聚合物，并通過AFM，TEM，TGA和XPS表征進(jìn)行確認(rèn)。研究結(jié)果顯示，基于GO的聚合物對(duì)胰蛋白酶的負(fù)載量達(dá)到773.9 mg/g。聚合物接枝在GO表面，支持三維胰蛋白酶固定。這種結(jié)構(gòu)不僅增加了胰蛋白酶的負(fù)載量，還大大提高了其與蛋白底物接觸的幾率。酶切效率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種類型的固定化胰蛋白酶的消化時(shí)間僅為游離胰蛋白

7、酶溶液的1/700，且酶切結(jié)果與溶液酶切具有相同的蛋白質(zhì)/肽鑒定規(guī)模。GO表面接枝不同聚合物的固定化酶聯(lián)合酶切在蛋白質(zhì)/肽段識(shí)別上至少增加18.3％及31.3%。
　　由于SI-ATRP與各種單體相容，具有不同疏水性和靜電特性的聚合物刷可以接枝在GO上，以操縱其對(duì)不同理化特性蛋白質(zhì)的親和力，從而實(shí)現(xiàn)更全面的蛋白質(zhì)組消化。因此，這種固定化酶切方法在涉及大量樣品處理的高通量臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
　　第二部分：基

8、于GO的固定化HER-2受體的制備以及HS630的LC-MS方法的建立與開發(fā)
　　酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法是生物大分子藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究的經(jīng)典方法。其具有靈敏度高、通量高、設(shè)備簡(jiǎn)易等優(yōu)點(diǎn)，但也存在線性范圍相對(duì)窄、易發(fā)生非特異性結(jié)合等缺點(diǎn)。近年來(lái)，基于液相色譜-質(zhì)譜連用（LC-MS/MS）的方法由于具有特異性好、通量大以及可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)等優(yōu)點(diǎn)，也越來(lái)越多

9、的應(yīng)用于生物大分子藥物的定量檢測(cè)中。ELISA方法與LC-MS/MS方法聯(lián)合應(yīng)用，互相補(bǔ)充，可以更全面深入的揭示藥物的藥代動(dòng)力學(xué)過程。然而，LC-MS/MS方法中如何將基質(zhì)中大量的內(nèi)源性蛋白質(zhì)去除而不損失低濃度抗體藥物的量是完成對(duì)其精確分析并獲得準(zhǔn)確藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的關(guān)鍵。
　　在本研究中，我們利用SI-ATRP聚合法，在GO表面原位接枝含醛基的長(zhǎng)鏈聚合物刷，高效固定人表皮生長(zhǎng)因子受體（HER-2），進(jìn)而達(dá)到對(duì)抗體偶聯(lián)藥物（ADC）

10、HS630的特異性捕獲。由于GO具有超大的比表面積和柔性結(jié)構(gòu)，其表面原位接枝長(zhǎng)鏈聚合物不僅可以提高捕獲受體的固載量，還可以降低與所富集藥物接觸的空間位阻，進(jìn)一步提高藥物富集的效率及特異性。我們對(duì)固定化受體與藥物的結(jié)合與解離方法進(jìn)行了初步研究，并初步開發(fā)了基于LC-MS/MS的HS630定量方法。采用ELISA定量分析HS630的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，方法的定量范圍為1.56~100 ng/mL，精密度、準(zhǔn)確度、特異性與選擇性以及穩(wěn)定性良好

11、。我們用該ELISA方法對(duì)食蟹猴靜脈滴注HS630（3 mg/kg）后的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了初步觀察。結(jié)果顯示，經(jīng)過GO-PAA-HER-2固定化受體富集前處理后使用LC-MS/MS方法檢測(cè)得到的血藥濃度-時(shí)間變化與既往使用ELISA方法所得到的結(jié)果基本趨勢(shì)一致，初步證明此種方法有可能運(yùn)用于HS630藥代動(dòng)力學(xué)研究，但兩種方法所檢測(cè)到的具體樣品血藥濃度數(shù)值存在一定差異，總體趨勢(shì)是LC-MS/MS方法檢測(cè)得到的血藥濃度偏低。推測(cè)與生物樣品保存