茉莉酸信號途徑參與調(diào)控沉香倍半萜生物合成的分子機(jī)制研究.pdf

1、茉莉酸(JA)及其衍生物統(tǒng)稱為茉莉素(JAs)，廣泛存在于植物中的一類植物內(nèi)源激素，對植物生長和發(fā)育具有廣泛的生理效應(yīng);同時可作為內(nèi)源信號分子參與植物的抗逆反應(yīng)。長期以來，對JA信號途徑的機(jī)制及功能的研究一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。白木香(Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg)為瑞香科(Thymelaeceae)沉香屬（Aquilaria）或擬沉香屬（Gyrinops）常綠喬木，是我國生產(chǎn)傳統(tǒng)名貴中藥材沉香的基

2、原植物，同時也是中藥沉香的正品來源。作為傳統(tǒng)中藥，沉香具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘等功效。
　　白木香只有在受到傷害時才能形成沉香，我們已證明了沉香是白木香防御反應(yīng)的產(chǎn)物。沉香主要由倍半萜類和苯乙基色酮類衍生物兩種類型的化合物組成。其中，倍半萜類化合物的生物合成途徑研究相對比較清晰，但對于它的調(diào)控途徑不清楚。前期研究中發(fā)現(xiàn)，外源茉莉酸甲酯(MeJA)能顯著誘導(dǎo)白木香樹和愈傷組織中沉香倍半萜物質(zhì)的合成與積累。這些結(jié)果表明，JA與

3、沉香倍半萜的形成有關(guān);但它是否直接參與調(diào)控以及如何調(diào)控沉香倍半萜的生物合成還不清楚。本文從分子層面上研究JA信號途徑與沉香倍半萜形成的關(guān)系，為揭示白木香結(jié)香機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究獲得了以下主要結(jié)果:
　　1、JA信號分子能調(diào)控沉香倍半萜的合成。結(jié)合白木香轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)與熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測分析，發(fā)現(xiàn)JA信號途徑中的關(guān)鍵基因顯著響應(yīng)外界脅迫，且均屬于響應(yīng)早期傷害的基因。熱激處理能誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞中內(nèi)源激素J

4、A和沉香倍半萜（α-愈創(chuàng)木烯，α-蛇麻烯和δ-愈創(chuàng)木烯）的快速大量合成;JA合成抑制劑能抑制JA和倍半萜的合成，在熱處理后12h以內(nèi)未檢測到沉香倍半萜成分，24 h后才檢測到少量倍半萜生成。
　　2、首次從白木香中，也是沉香屬植物中分離并克隆了JA信號途徑中的5個關(guān)毽基因(LOX、 COI1、NINJA、JAZ和MYC2)的cDNA全長序列。分別命名為，AsLOX1、AsCOI1、ANINJA1、AsJAZ1和AsMYC2，為倍半

5、萜合成過程中JA信號途徑的研究奠定基礎(chǔ)。
　　3、基本明確了白木香AsJA Z1基因功能，過表達(dá)AsJAZ1基因能抑制擬南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11的表達(dá)，該基因極有可能是調(diào)控沉香倍半萜合酶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子之一。通過亞細(xì)胞定位分析，AsJAZ1基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核中，屬于核蛋白;基因組織表達(dá)模式分析表明，該基因在根、莖、葉和枝中均有表達(dá)，但以葉中的表達(dá)量最高。將白木香AsJAZ1基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，該基因

6、過表達(dá)抑制了擬南芥中TPS21和TPS11基因的表達(dá)。
　　4、基本明確了白木香AsMYC2基因功能，AsMYC2基因過表達(dá)能正調(diào)控擬南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11的表達(dá)，該基因極有可能是調(diào)控沉香倍半萜合酶基因表達(dá)的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。亞細(xì)胞定位分析表明，AsMYC2基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核中，屬于核蛋白;基因組織表達(dá)模式分析表明，該基因在根、莖、葉和枝中均有表達(dá)，但以莖和根中的表達(dá)量最高;AsMYC2基因過表達(dá)能正調(diào)控野

7、生型擬南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11的表達(dá);在擬南芥myc2-2突變體中，AsMYC2基因過表達(dá)能一定程度上恢復(fù)對TPS21和TPS11基因表達(dá)的調(diào)控作用。
　　5.明確了白木香AsJAZ1蛋白與AsMYC2蛋白間存在體外相互作用。通過基因重組技術(shù)，成功的構(gòu)建了AsJAZ1基因和AsMYC2基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功的誘導(dǎo)了His-AsJAZ1和GST-AsMYC2融合蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行了蛋白純化，高質(zhì)量蛋白的