廣藿香原生質(zhì)體融合與茉莉酸甲酯參與調(diào)控的百秋李醇生物合成機(jī)制初步研究.pdf

1、廣藿香（Pogostemon cablin（Balnco） Benth.）為唇形科刺蕊草屬植物，具有芳香化濁，開胃止嘔，解暑的功效，為“十大廣藥”之一，其中以“石牌”品種最優(yōu)。為解決抗性下降、資源短缺的現(xiàn)狀，考慮以廣藿香原生質(zhì)體對稱融合的多倍體育種方法改良品種，可以在提高石牌廣藿香有效成分及產(chǎn)量的基礎(chǔ)上避免化學(xué)誘導(dǎo)多倍體帶來的嵌合體缺陷；此外，在原有研究基礎(chǔ)上通過添加MeJA誘導(dǎo)子的廣藿香懸浮細(xì)胞與空白對照的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，建立原始數(shù)據(jù)

2、，挖掘相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，更深入地探究茉莉酸信號參與調(diào)控的百秋李醇生物合成機(jī)制，為提升廣藿香藥源品質(zhì)及其可持續(xù)開發(fā)利用提供新的思路和技術(shù)手段。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）廣藿香懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體分離
　　在原有實(shí)驗基礎(chǔ)上優(yōu)化了酶解分離方案，考察了預(yù)處理方法、酶液pH、酶解溫度對廣藿香原生質(zhì)體分離的影響。最終確定選取培養(yǎng)9-15 d處于對數(shù)生長期的廣藿香懸浮細(xì)胞為原材料，混合酶液選用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，質(zhì)量體積比依次為1.

3、5％、0.5%、0.8%，酶液滲透勢以0.4moL/L甘露醇調(diào)節(jié)，pH設(shè)為5.8，溫度25℃，以50rpm避光振蕩酶解12h，最終產(chǎn)量為13.2×105個/g，活力為81.8%。
　?。?）廣藿香懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)
　　原生質(zhì)體培養(yǎng)主要考察了培養(yǎng)方法、培養(yǎng)密度、培養(yǎng)基激素配比、銨鹽含量、碳源、酸水解酪蛋白含量。最終確定以銨鹽減半的MS1培養(yǎng)基進(jìn)行海藻酸鈉包埋，激素選用0.2mg/L NAA、2.0mg/L6-BA，培養(yǎng)密度

4、為2.0×105個/mL，蔗糖添加量1.0%，酸水解酪蛋白500mg/L。在培養(yǎng)第6天觀察到細(xì)胞第一次分裂，14天左右細(xì)胞開始大量分裂，分裂頻率為6.91%，第16天形成細(xì)胞團(tuán)，植板率為1.83%，培養(yǎng)第63天左右觀察到肉眼可見愈傷組織。
　?。?）廣藿香懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體融合
　　本實(shí)驗以測定融合產(chǎn)物直徑變化范圍的物理選擇法來進(jìn)行產(chǎn)物篩選，經(jīng)測量與統(tǒng)計，確立融合產(chǎn)物篩選范圍是69.33-87.35μm。采取高pH高鈣法對稱融

5、合廣藿香原生質(zhì)體，考察了PEG濃度、融合時間、融合密度、融合液加入量對融合的影響。最終確定選用40%的PEG6000進(jìn)行化學(xué)促融30min，融合液加入量為原生質(zhì)體懸浮液體積的0.5倍，融合密度2.0×105個/mL，聚合率57.19%，融合產(chǎn)物經(jīng)海藻酸鈉包埋培育2個月，觀察到再生愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基，暫未觀察到再生植株，培育方法有待進(jìn)一步優(yōu)化。
　　（4）茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)后廣藿香懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序<

6、br>　　分別對添加了MeJA誘導(dǎo)子的廣藿香懸浮細(xì)胞與空白對照組進(jìn)行了Illumina轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得了662270條Unigenes，注釋率為74.04%；獲得KOG功能注釋Unig ene共有328994條，涉及25個功能大類；GO庫中注釋到的Unigene共有607785條，有339437條Unigenes歸入生物學(xué)過程，129556條Unigenes歸入細(xì)胞組分，138792條Unigenes歸入分子功能；KEGG庫注釋到16

7、3979條Unigenes，歸屬到345條代謝通路，與萜類相關(guān)的通路有8條，涉及943條Unigenes，萜類骨架生物合成MVA途徑中共注釋到5個相關(guān)酶基因，涉及44條Unigenes，萜類骨架生物合成DXP途徑中共注釋到7個相關(guān)酶基因，涉及20條Unigenes，倍半萜合成途徑共注釋到6個相關(guān)酶基因，涉及83條Unigenes，分別為法呢基二磷酸法呢基轉(zhuǎn)移酶（farnesyl-diphosph ate farnesyltransfer

8、ase）、角鯊烯單加氧酶（squalene monooxygenase）、NAD+依賴性法呢醇脫氫酶（NAD+-dependent farnesol dehydrogenase）、(E,E)-α-法呢烯合酶（alp ha-fa-rnesene synthase）、(-)-大根香葉烯合酶[(-)-germacrene D synthase]、丙二烯加氧酶（pre-mnaspirodiene oxygenase）；此外鑒定出185221個S