PRL-3和CDH22雙基因表達(dá)抑制的結(jié)直腸癌細(xì)胞模型的建立及初步研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一,近十年來,結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。轉(zhuǎn)移是影響患者治療效果和導(dǎo)致患者死亡的主要因為,也是結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的直接因為。
　　 促肝細(xì)胞再生磷酸酶-3(phosphataseofregeneratingliver-3,PRL-3),屬于蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶家族成員,現(xiàn)被認(rèn)為是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的少數(shù)特異性表達(dá)分子之一。CDH22(又稱為PB-cadherin)與

2、E-鈣粘附蛋白同屬于鈣粘附蛋白家族經(jīng)典型亞類成員。目前研究發(fā)現(xiàn),鈣粘附蛋白家族中有許多成員都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn)β-catenin及其通路相關(guān)基因的改變在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。
　　 在β-catenin通路相關(guān)基因中,處于上游的E-cadherin及處于核心地位的β-catenin正常表達(dá)定位于上皮細(xì)胞膜,結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸腺瘤惡變和結(jié)直腸癌組織E-cadherin、β-c

3、atenin胞膜表達(dá)不同程度缺失,β-catenin呈胞漿(胞核)異位表達(dá)。下游通路中的靶基因cyclinD1是調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期中增殖期的主要因子,其過度表達(dá)和異常調(diào)控均可導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生異常,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。正常結(jié)直腸黏膜cyclinD1表達(dá)均為陰性,結(jié)直腸癌組織中cyclinD1主要呈細(xì)胞核表達(dá),少數(shù)腫瘤細(xì)胞呈細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。探討β-catenin通路相關(guān)基因在結(jié)直腸癌形成過程中的變化規(guī)律,將有助于研究腫瘤惡性表型多樣性的分子機(jī)

4、制。同時也應(yīng)認(rèn)識到,人體是一個由多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑交織成網(wǎng)絡(luò)、共同作用的有機(jī)整體,在研究β-catenin/Wnt途徑的同時,研究其他途徑的作用以及β-catenin/Wnt通路與其他因素之間的相互影響,將為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供一個新的解釋。
　　 RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)的出現(xiàn)為基因功能研究提供了一種新的、高效和特異的功能基因組研究策略,已經(jīng)應(yīng)用于功能基因組學(xué)、藥物靶點篩選和細(xì)胞信號傳導(dǎo)通

5、路分析等方面。
　　 本研究采用RNAi技術(shù)建立PRL-3和CDH-22雙基因表達(dá)下調(diào)的結(jié)直腸癌細(xì)胞模型,然后對其生物學(xué)特性的改變進(jìn)行了初步的研究,通過比較其與同一親本來源的對照組細(xì)胞的形態(tài)、生物學(xué)特性、基因表達(dá)、蛋白差異等,探討PRL-3、CDH22與β-catenin/Wnt信號通路相關(guān)基因的相互作用,本研究有助于更深入了解腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.靶向人CDH22基因RNAi慢病毒的

6、包裝、滴度測定2.慢病毒對SW480/PRL-3-細(xì)胞的二次感染將5×104個SW480/PRL-3-細(xì)胞接種于24孔板,37℃,5％CO2培養(yǎng),16h后其融合達(dá)60％-70％,用靶向人CDH22基因的RNAi慢病毒以MOI為40感染細(xì)胞,添加polybrene,終濃度為8mg/ml。28h后去除病毒液,更換為含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 3.有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株,對所得的各單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大

7、培養(yǎng)4.應(yīng)用熒光定量PCR及Westernblot檢測各克隆PRL-3及CDH22基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平,綜合二者結(jié)果,鑒定出在mRNA及蛋白表達(dá)水平PRL-3及CDH22基因均顯著降低的克隆株,從而建立PRL-3和CDH22雙基因表達(dá)沉默的結(jié)直腸癌細(xì)胞模型,命名為SW480/PRL-3-/CDH22-。
　　 5.細(xì)胞蠟塊、流式細(xì)胞術(shù)、MTT法、比較SW480/PRL-3-/CDH22-與對照組SW480、SW480/M

8、ock、SW480/PRL-3.在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長周期、細(xì)胞增殖能力方面的差異。
　　 6.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測SW480/PRL-3-/CDH22-及其同一親本來源的對照組細(xì)胞株β-catenin/Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.慢病毒滴度測定收集病毒上清液,測定慢病毒的病毒滴度為8×105U/ml。
　　 2.細(xì)胞二次感染后進(jìn)行克隆化培養(yǎng):經(jīng)有限稀釋法共獲得17個單克隆細(xì)胞

9、株,對所得的各單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　 3.PRL-3和CDH22雙基因表達(dá)沉默的結(jié)直腸癌細(xì)胞模型的建立及鑒定熒光定量PCR的結(jié)果顯示,挑取的各個單克隆都有不同程度CDH22基因的表達(dá),通過公式計算,發(fā)現(xiàn)克隆2的干擾效率最高,表達(dá)量僅為對照的25％,即干擾效率為75％,其次是克隆1,表達(dá)量僅為對照的27％,即干擾效率為73％。熒光定量PCR結(jié)果顯示,挑取的各個單克隆均有不同程度PRL-3基因的表達(dá),通過公式計算,發(fā)現(xiàn)克隆

10、4的干擾效率最高,表達(dá)量僅為對照的27％,即干擾效率為73％,其次是克隆1,表達(dá)量僅為對照的30％,即干擾效率為70％。通過熒光定量PCR初步得到4個可能符合實驗預(yù)期目的克隆株。
　　 WesternBlot進(jìn)一步檢測這4個克隆株P(guān)RL-3及CDH22蛋白表達(dá)水平。綜合考慮熒光定量PCR、WesternBlot的結(jié)果,證實PRL-3及CDH22穩(wěn)定表達(dá)敲低的細(xì)胞克隆為克隆1,命名為SW480/PRL-3-/CDH22-。

11、　　 4.PRL-3和CDH22雙基因表達(dá)抑制的結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外生物學(xué)特性的改變細(xì)胞蠟塊HE染色顯示:SW480/PRL-3-較SW480/PRL-3-/CDH22-、SW480、SW480/Mock細(xì)胞胞漿豐富,細(xì)胞連接緊密,SW480/PRL-3-/CDH22-、SW480、SW480/Mock3組細(xì)胞之間差異不顯著。應(yīng)用MTT法,我們檢測SW480、SW480/Mock、SW480/PRL-3-、SW480/PRL-3-/CD

12、H22-細(xì)胞體外增殖能力,經(jīng)析因方差分析,四組差異具有顯著性(F=952.067,P=0.000)；經(jīng)LSD法多重比較,結(jié)果表明,SW480細(xì)胞增殖速度最快,SW480/Mock、SW480/PRL-3-/CDH22-細(xì)胞次之,而SW480/PRL-3-細(xì)胞的增殖速度最慢。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化,SW480、SW480/Mock、SW480/PRL-3-/CDH22-及SW480/PRL-3-四種細(xì)胞的S期細(xì)胞平均比例分別為46

13、.6％、38.3％、30.9％和20.8％,統(tǒng)計分析結(jié)果顯示四種細(xì)胞的S期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.994,P=0.000)。SW480/PRL-3-細(xì)胞大部分阻滯在G1期,S期所占比例明顯減少。
　　 5.PRL-3和CDH22雙基因表達(dá)抑制的結(jié)直腸癌細(xì)胞及對照組細(xì)胞株β-catenin/Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況細(xì)胞免疫化學(xué)實驗顯示:
　　 1)SW480及SW480/Mock細(xì)胞E-cadherin在胞膜

14、表達(dá)呈不同程度缺失；
　　 SW480/PRL-3-/CDH22-細(xì)胞胞膜呈間斷性或異位表達(dá),但并未出現(xiàn)明顯的膜表達(dá)缺失；SW480/PRL-3-細(xì)胞幾乎所有細(xì)胞E.cadherin成明顯的胞膜著色。
　　 2)SW480及SW480/Mock細(xì)胞β-catenin膜表達(dá)缺失明顯；SW480/PRL-3-/CDH22-細(xì)胞β-catenin從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核膜及核周區(qū)域；SW480/PRL-3-細(xì)胞β-catenin重

15、新定位于細(xì)胞膜。
　　 3)CyclinD1陽性著色定位于細(xì)胞核。SW480及SW480/Mock細(xì)胞約85％的細(xì)胞CyclinD1呈核陽性表達(dá),SW480/PRL-3-/CDH22-細(xì)胞約50％細(xì)胞呈核陽性表達(dá),SW480/PRL-3-細(xì)胞約30％的細(xì)胞呈核陽性表達(dá)。
　　 4)4組細(xì)胞株CK均呈細(xì)胞膜陽性表達(dá),無顯著差異。
　　 5)4組細(xì)胞株Vimentin均未見陽性表達(dá)。
　　 6)Gsk-3β在

16、4組細(xì)胞中表現(xiàn)為胞漿表達(dá)。其表達(dá)強(qiáng)度依次為:SW480/PRL-3-/CDH22-、SW480/PRL-3-、SW480/mock、SW480。
　　 結(jié)論：
　　 1.轉(zhuǎn)染一種基因慢病毒干擾載體的細(xì)胞株可再次接受靶向另一基因干擾序列的慢病毒顆粒的轉(zhuǎn)染,為研究慢病毒二次感染細(xì)胞并穩(wěn)定干擾各靶基因的表達(dá)提供有實用價值的實驗方法。
　　 2.成功建立PRL-3和CDH22雙基因表達(dá)抑制的結(jié)直腸癌細(xì)胞模型。
　　

17、 3.PRL-3、CDH22表達(dá)呈現(xiàn)不同水平時,Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)強(qiáng)度及部位發(fā)生改變。單獨下調(diào)PRL-3基因,CDH22表達(dá)上調(diào),細(xì)胞株細(xì)胞膜E-cadherin恢復(fù)連續(xù)線性表達(dá),細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的β-catenin重新定位于細(xì)胞膜,細(xì)胞核cyclinDl低表達(dá)。細(xì)胞之間連接變緊密,細(xì)胞增殖相對減慢,細(xì)胞阻滯在G1期,S期所占比例明顯減少。
　　 4.PRL-3基因可通過下調(diào)CDH22表達(dá)而誘導(dǎo)