乙醇對氧化應(yīng)激損傷和HBV復(fù)制對肝癌系細(xì)胞蛋白酶體活性的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)作為一種非細(xì)胞毒性的嗜肝病毒,感染機(jī)體后將導(dǎo)致急慢性肝炎、肝硬化、肝癌等一系列肝臟疾病的發(fā)生,成為危害人類健康的一項嚴(yán)重問題。HBV感染后,決定病程轉(zhuǎn)歸的一個主要因素是機(jī)體的免疫反應(yīng)能力.尤其是特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的反應(yīng)水平。表達(dá)抗原特異性受體細(xì)胞毒性T(CD8+T)淋巴細(xì)胞能夠識別HBV感染肝細(xì)胞表面的MHC-I抗原肽段復(fù)合物,對感染細(xì)胞的病毒進(jìn)行清除,當(dāng)特異性的CTL建立以后,感染的肝細(xì)胞表面如果

2、不表達(dá)MHC-Ⅰ抗原肽段復(fù)合物,也沒法對病毒進(jìn)行清除,而且最近的研究指出氧化應(yīng)激損傷與丙肝病毒感染協(xié)同作用減弱了肝細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)處理加工MHC-Ⅰ抗原的蛋白酶體的活性,也有研究證據(jù)表明乙肝病毒蛋白與蛋白酶體亞基之間可以相互作用降低肝細(xì)胞本身的抗原提呈功能,有利于病毒病原體躲避機(jī)體的免疫反應(yīng)。因此乙肝病毒感染肝細(xì)胞的處理加工病毒抗原的能力有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　 本研究利用肝癌細(xì)胞系HepG2以及在HepG2基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染了HBV的H

3、epG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞模型,初步探討比較HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞對乙醇致氧化應(yīng)激損傷的敏感性差異,通過Western bloting方法檢測LMP2免疫蛋白酶體的亞基,研究氧化應(yīng)激損傷對HepG2和HepG 2.2.15細(xì)胞處理加工病毒抗原能力的影響。實(shí)驗過程中,分別用1.5％、3％、5％、8％濃度的乙醇作用HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞16h以后收集上清檢測谷草轉(zhuǎn)氨酶,四甲基偶氮唑鹽(MTT)計算細(xì)胞活性抑制

4、率。兩種細(xì)胞1.5％、5％乙醇處理16小時后用WesternBlot檢測免疫蛋白酶體亞基LMP2的表達(dá)。通過上述研究方案獲得如下結(jié)果:
　　 HepG2.2.15細(xì)胞對3％、5％的乙醇誘導(dǎo)損傷更敏感。HepG2.2.15細(xì)胞的LMP2表達(dá)比HepG2細(xì)胞低,1.5％乙醇處理16小時以后,HepG2.2.15細(xì)胞的蛋白酶體亞基LMP2表達(dá)比HepG2細(xì)胞下調(diào)更明顯。
　　 我們的研究提示了HBV的復(fù)制和氧化應(yīng)激損傷降低了蛋

5、白酶體亞基LMP2的表達(dá),推測HBV的復(fù)制可能會造成肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,會減弱肝細(xì)胞的對MHC-Ⅰ類分子限制的病毒抗原的提呈。
　　 目的:建立一種簡便經(jīng)濟(jì)的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的原代肝細(xì)胞的分離純化方法,并進(jìn)行培養(yǎng),觀察HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細(xì)胞的生物學(xué)功能,探索HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細(xì)胞作為抗乙肝病毒藥物藥效學(xué)研究的細(xì)胞模型的潛能。
　　 方法:采用稍加改良的兩步膠原酶灌流法分離獲取HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細(xì)胞,用perc

6、oll密度梯度離心法純化原代肝細(xì)胞,并進(jìn)行原代培養(yǎng)。以臺盼藍(lán)染色法測細(xì)胞活力,顯微鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)變化,檢測培養(yǎng)體系不同時間培養(yǎng)上清液中白蛋白、乳酸脫氫酶(LDH)、尿素的含量以及不同時間培養(yǎng)上清液中乙肝表面抗原(HBS-Ag)、e抗原(HBe-Ag)、HBVDNA分泌水平,利用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細(xì)胞模型,通過檢測培養(yǎng)上清HBS-Ag、HBe-Ag、HBVDNA分泌水平對Bay-4109的抗乙肝病毒作用進(jìn)行藥效學(xué)評價。
　　

7、 結(jié)果:改良的兩步膠原酶消化法結(jié)合percoll密度梯度離心法所獲取的肝細(xì)胞活細(xì)胞達(dá)到90％,純度95％以上,貼壁良好、活性高、功能強(qiáng):LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成等指標(biāo)在1周內(nèi)呈現(xiàn)規(guī)律性變化,第3和第4天時LDH漏出量最低,白蛋白分泌及尿素合成功能正常,HBS-Ag在一周內(nèi)分泌水平穩(wěn)定、HBe-Ag在1～2天分泌高峰、后逐漸下降,HBVDNA分泌水平表明所分離的肝細(xì)胞在培養(yǎng)第3～4天功能最佳。Bay-4109作用于HBV轉(zhuǎn)基因