系統(tǒng)性紅斑狼瘡MicroRNA表達譜和功能的初步研究.pdf

1、背景
　　 MicroRNAs（miRNAs）屬非編碼RNA大家族，高度保守，廣泛存在于從病毒、線蟲、植物到動物體內(nèi)，參與生物體的生長、發(fā)育、衰老、凋亡的調(diào)控。成熟miRNA通過核酸序列互補識別特定的目標mRNA，使之降解或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，達到調(diào)控基因表達的目的。生物信息學預測約1/3的mRNA受miRNA調(diào)控。在免疫細胞中表達的miRNA超過100個，在固有免疫及適應性免疫中發(fā)揮重要作用。近年來已經(jīng)有研究顯示

2、在一些疾病中某些特定的miRNA與疾病的發(fā)生發(fā)展和預后密切相關，miRNA表達譜可以作為疾病的診斷和預后的指標。
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是最為經(jīng)典的自身免疫病，其特征為多系統(tǒng)受累，體內(nèi)多種自身抗體產(chǎn)生、免疫復合物沉積在多種組織器官引起的免疫病理損傷，但具體的發(fā)病機制仍不清楚。已經(jīng)有許多研究證實T、B細胞的功能異常在SLE的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。鑒于miRNA在調(diào)節(jié)T、B等免疫細胞中起重要作用，因此我們推測miRNA可

3、能在SLE的發(fā)病中同樣發(fā)揮著重要作用。外周血PBMC是研究miRNA在SLE免疫細胞作用很好的靶點，本研究從高通量篩選miRNA在SLE患者PBMC中表達差異入手，對miRNA在SLE發(fā)病機制中的作用進行了初步研究。
　　 目的
　　 本研究通過篩選SLE患者PBMC中miRNA表達譜差異，尋找與SLE發(fā)病相關的miRNA，分析miRNA相對表達量與SLE臨床譜的相關性，初步探討了miR-125b在SLE中的可能的作用機

4、制。
　　 方法：
　　 1 MicroRNA表達譜芯片技術(shù)檢測847個成熟miRNAs在初治SLE和正常對照組間表達水平差異，應用分層聚類分析篩選并獲得一批SLE特異性表達的miRNA分子，采用Real-timePCR方法對芯片的結(jié)果進行驗證。
　　 2進一步擴大樣本量，采用Real-timePCR方法對miR-125b在SLE患者、正常對照組及疾病對照組的表達水平進行檢測，其中包括58例SLE患者、26例正常

5、對照、8例類風濕關節(jié)炎（RA）患者、8例干燥綜合征（pSS）患者，分析其與SLE臨床譜的相關性；采用流式細胞儀分選免疫細胞，Real-timePCR方法檢測miR-125b在不同免疫細胞中的相對表達量。
　　 3應用生物信息學方法預測miR-125b的靶基因。構(gòu)建靶基因表達載體，通過雙熒光報告轉(zhuǎn)染實驗，體外運用熒光報告系統(tǒng)檢測過表達miR-125b后對雙熒光素酶報告基因活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1對847

6、個成熟miRNAs的表達譜檢測結(jié)果表明存在SLE特異性的miRNA表達譜。篩選并獲得了一批SLE特異性表達的miRNA分子，其中有37個miRNA在SLE和正常人PBMC中表達差異顯著，26個表達下調(diào)，11個表達上調(diào)，揭示了SLE患者PBMC中存在著特異的miRNA表達譜。進一步用Real-time PCR對上述結(jié)果進行了驗證，得出相同結(jié)論。
　　 2擴大樣本量進一步證實了miR-125b在SLE患者外周血PBMC中表達量明顯減

7、低，與正常對照比較有明顯差異，且降低幅度與SLE臟器受累相關。比較miR-125b在T、B細胞及非T、B細胞表達量中的差異發(fā)現(xiàn)miR-125b在T細胞表達差異最為明顯。
　　 3運用TargetScan等軟件對miR-125b的靶基因進行了預測，根據(jù)軟件評分及基因功能選擇了Etsl、TNFAIP3和STAT3作為候選靶基因。構(gòu)建了Etsl、TNFAIP3和STAT3的雙熒光酶報告基因載體，體外實驗證實miR-125b可與Etsl