河南省呼吸道合胞病毒分子生物學(xué)研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)簡(jiǎn)稱合胞病毒,是重要的嬰幼兒急性呼吸道感染病原體,可引起間質(zhì)性肺炎及毛細(xì)支氣管炎等疾病。RSV感染非常普遍,超過90％的兒童在2歲以前感染過RSV,而且都經(jīng)歷過1次或多次感染。在發(fā)展中國家,5歲以下兒童因RSV感染住院病人的死亡率為7％,發(fā)達(dá)國家為0.5％~2.0％。我國RSV感染研究缺乏全國資料,部分地區(qū)資料顯示,北京市兒童醫(yī)院研究顯示在1996~1999

2、年期間,住院的病人中有呼吸道感染癥狀病例1183例,RSV陽性者標(biāo)本255例,占送檢標(biāo)本總數(shù)的21.5％;沈陽地區(qū)1999~2000年調(diào)查顯示小兒急性呼吸道感染病例的44.62％由RSV引起。我省尚未開展RSV感染的病原學(xué)研究,僅僅開展了RSV-IgM抗體的檢測(cè)工作,也沒有對(duì)于嬰幼兒急性呼吸道感染病例的病原學(xué)流行趨勢(shì)的研究。
　　為了了解河南省嬰幼兒急性呼吸道感染病例病原學(xué)分布狀況,探討呼吸道合胞病毒在我省的流行規(guī)律,積累呼吸道合

3、胞病毒毒株,了解呼吸道合胞病毒黏附蛋白G基因的分子生物學(xué)特征,確定我省呼吸道合胞病毒分離株的型別,從而填補(bǔ)我省呼吸道合胞病毒病原學(xué)研究的空白,我們?cè)O(shè)立并開展了此項(xiàng)研究工作。另外,通過對(duì)呼吸道合胞病毒各種檢測(cè)、鑒定方法的對(duì)比,比較各種檢測(cè)方法檢測(cè)效果的差異,在尋找呼吸道合胞病毒快速檢測(cè)方法、建立應(yīng)急檢驗(yàn)平臺(tái)等突發(fā)公共衛(wèi)生事件的預(yù)防控制工作方面,提供可靠的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。
　　材料與方法：研究對(duì)象來源于2006年10月-2007年5月

4、期間河南省人民醫(yī)院兒科門診和住院病例,以及河南省流感樣病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中的病例,對(duì)診斷為急性支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎、肺炎,符合篩選條件的病例確定為研究對(duì)象。對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行調(diào)查并采集咽拭液標(biāo)本,選擇Hep-2、Vero細(xì)胞系,采用組織培養(yǎng)的方法在咽拭液標(biāo)本中分離培養(yǎng)呼吸道合胞病毒株,運(yùn)用相關(guān)試劑盒提取咽拭液標(biāo)本RNA模板,采用Ag-ELISA、real-time PCR等方法鑒定呼吸道合胞病毒。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)RSV黏附蛋白G基因的上下游引物,

5、對(duì)鑒定陽性病例運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增該基因,陽性擴(kuò)增產(chǎn)物運(yùn)用核苷酸測(cè)序方法獲得G基因全長(zhǎng)核苷酸序列,將所獲得的序列與已知參考毒株G基因序列一同導(dǎo)入DNASTAR軟件,進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。運(yùn)用卡方檢驗(yàn)等相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較各檢測(cè)方法的敏感性差異,結(jié)合實(shí)際工作,找出快速實(shí)用的檢測(cè)方法。
　　結(jié)果：通過收集和篩選資料,共有126例病例符合本研究所規(guī)定的條件,對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行調(diào)查和采集臨床標(biāo)本,共采集咽拭液標(biāo)本126份。經(jīng)過

6、組織培養(yǎng)共有58份標(biāo)本出現(xiàn)CPE,其中5份為典型細(xì)胞融合病變,53份為其他細(xì)胞病變。經(jīng)過real-time PCR方法鑒定出12份為呼吸道合胞病毒,經(jīng)過Ag-ELISA鑒定出8份呼吸道合胞病毒,通過針對(duì)黏附蛋白G蛋白基因的引物的RT-PCR反應(yīng),共有6份標(biāo)本擴(kuò)增出了陽性條帶,對(duì)這6份病毒標(biāo)本的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了核苷酸序列測(cè)定,獲得這些病毒的G蛋白基因全長(zhǎng)核苷酸序列,分別編號(hào)為henan2006/A36、henan2006/A39

7、、henan2006/207、henan2006/305、henan2006/417、henan2006/589,其核苷酸序列長(zhǎng)度均為922bp。將所得到的核苷酸序列導(dǎo)入DNASTAR軟件MegAlign模塊中,進(jìn)行核苷酸序列同源性分析,通過分離毒株序列兩兩比較,其同源性最大99％,最小88％,將所測(cè)核苷酸序列推導(dǎo)出氨基酸序列進(jìn)行同源性比較,同源性在90％~95％之間,其與RSVA型毒株序列同源性為87％~94％,與RSVB型毒株序列同

8、源性33％~35％。從Pubmed基因數(shù)據(jù)庫中查找并下載多條RSV毒株G蛋白基因核苷酸參考序列,與樣本序列導(dǎo)入DNASTAR軟件MegAlign模塊中進(jìn)行比較,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,確定病毒型別。通過比較不同的RSV鑒定方法,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,共檢測(cè)12株呼吸道合胞病毒,其中組織培養(yǎng)分離出5株病毒,real-time PCR檢出12株病毒,Ag-ELISA檢出8株病毒,對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,檢出率經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn),real-time PCR和