翠綠針毛蕨化學成分及其抗腫瘤活性的研究.pdf

1、翠綠針毛蕨Macrothelypteris viridifrons(Tagawa) Ching是金星蕨科針毛蕨屬植物,廣泛分布于長江流域以南各省區(qū),具有清熱解毒,利尿,止血等功效。目前,國內(nèi)外有關其化學成分和生物活性的報道很少,為了開發(fā)翠綠針毛蕨的藥用價值和研究其生物活性,本文對翠綠針毛蕨總黃酮活性部位的純化工藝、化學成分及抗腫瘤作用進行了研究,同時,對新化合物DHEC抗腫瘤作用機制進行了探討,并建立了翠綠針毛蕨藥材的質(zhì)量標準。

2、　　在對總黃酮純化工藝的研究中,采用堿溶酸沉法結合大孔樹脂純化法,建立了翠綠針毛蕨總黃酮的純化工藝,最終得到轉(zhuǎn)移率不低于59.52％,純度不低于54.85％的翠綠針毛蕨總黃酮。最佳提取工藝為:以70％乙醇為溶劑,料液比1:20,80℃下回流提取2次,每次60min;最佳純化工藝為:堿溶酸沉法(堿液溶解最佳pH值為7.0,酸液沉淀最佳pH值為1.0-2.0);大孔樹脂法(選用HPD500樹脂,上樣液pH值為5.0,上樣液濃度為4.0mg/

3、mL,吸附流速為2.0BV/h,洗脫劑為70％乙醇,洗脫劑體積為3.0BV,洗脫流速為2.0BV/h)。
　　通過體內(nèi)外抗腫瘤活性的對比研究,結果顯示翠綠針毛蕨總黃酮可顯著抑制多種腫瘤細胞的增殖以及小鼠S180肉瘤模型腫瘤的生長,其活性明顯優(yōu)于總提取物。另外,以HepG2人肝癌細胞為模型,采用MTT法評價細胞增殖,PI染色法檢測細胞周期,Annexin V-FITC/PI雙染法和Hoechst33258熒光染色法檢測細胞凋亡等手段

4、來進一步研究總黃酮的體外抗腫瘤作用,結果顯示翠綠針毛蕨總黃酮可誘導HepG2細胞凋亡,且能使細胞周期停滯于G2/M期。同時,在小鼠H22肝癌模型中,采用抑瘤率,生化指標檢測,HE染色,免疫組化等方法來深入分析翠綠針毛蕨總黃酮的抗腫瘤作用,結果顯示翠綠針毛蕨總黃酮可以顯著抑制腫瘤的生長,且對血管形成具有一定的抑制作用,提示其作用機制可能與抑制腫瘤組織血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡有關。
　　在總黃酮化學成分研究中,采用現(xiàn)代色譜和光譜技術

5、,從翠綠針毛蕨總黃酮中分離得到19個化合物,其中9個是結構新穎罕見的B環(huán)非苯環(huán)的黃酮類化合物,包括1個新化合物8,分別為5,7-二羥基色原酮(1);5,7-二羥基-2-(1-羥基-2,6-二甲氧基-4-酮-環(huán)己烷)-色原酮(2);5,7-二羥基-2-(1,2-異丙二氧基-4-酮-環(huán)己-5-烯)-色原酮(3);原芹菜素(4);芹菜素(5);柚皮素(6);山奈酚(7);2-(順-1,2-二羥基-4酮-環(huán)己-5-烯)-5-羥基-7-乙氧基色原

6、酮(8);2-(順-1,2-二羥基-4-酮-環(huán)己-5-烯)-5,7-二羥基-色原酮(9);槲皮素(10);2-(反-1,4-二羥基環(huán)己烷)-5,7-二羥基-色原酮(11);5,7-二羥基-2-(1,4-二羥基-環(huán)己-2,5-二烯)-色原酮(12);芹菜素-4'-葡萄糖苷(13);柚皮素-4'-葡萄糖苷(14);山奈酚-3-葡萄糖苷(15);5,7-二羥基-2-(1,4-二羥基環(huán)己烷)-色原酮-4'-O-葡萄糖苷(16);4'-羥基原芹菜

7、素-4'-葡萄糖苷(17);山奈酚-3-蘆丁糖苷(18);槲皮素-3-蘆丁糖苷(19)。所有化合物均為首次從該植物中分離得到。
　　同時,采用MTT法、流式細胞術、熒光顯微鏡、免疫印跡實驗等方法對新化合物2-(順-1,2-二羥基-4酮-環(huán)己-5-烯)-5-羥基-7-乙氧基色原酮(DHEC)誘導HT-29人結腸癌細胞凋亡的機制進行了深入探討,結果顯示DHEC能顯著抑制HT-29細胞增殖和誘導其凋亡,并能引起線粒體內(nèi)膜電位(MMP)顯

8、著降低,細胞內(nèi)活性氧(ROS)的異常升高,細胞色素C的大量釋放,PARP、procaspase-3、-8、-9的活化裂解,促凋亡蛋白Bax和Bad蛋白表達顯著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表達顯著降低;同時,引起MAPK信號傳導通路的3個成員(ERK、JNK、P38 MAPK)發(fā)生磷酸化激活;所有結果表明DHEC可經(jīng)凋亡途徑抑制HT-29人結腸癌細胞生長增殖,其中ROS介導的,Bcl-2家族蛋白調(diào)控的,Caspase途徑依賴的