膀胱癌順鉑耐藥與其基因甲基化相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　通過了解順鉑耐藥膀胱癌細胞中DNA甲基化譜的改變,探索與發(fā)生順鉑耐藥密切相關(guān)的基因的甲基化及其蛋白表達的變化,為闡明膀胱癌化療耐藥機制提供新的實驗依據(jù)。
　　方法:
　　(1)順鉑耐藥膀胱癌細胞株的建立:利用順鉑濃度梯度遞增法(0.2-2.0mg/L),在T24膀胱癌細胞中建立順鉑耐受的細胞株亞型(T24/DDP),并對細胞的各項生物學(xué)指標進行檢測,包括順鉑敏感性、細胞形態(tài)學(xué)、細胞生長曲線及細胞周期等。

2、r>　　(2)順鉑耐藥膀胱癌細胞DNA甲基化譜分析與耐藥相關(guān)甲基化基因的篩選:DNA甲基化芯片對T24及T24/DDP細胞基因組的DNA甲基化譜進行分析,并通過統(tǒng)計學(xué)方法,篩選高甲基化,及低甲基化修飾基因。利用realtime-PCR方法對篩選出的具有表達差異的甲基化修飾基因進行分析,并結(jié)合文獻資料,最終采用MSP法,對篩選出的甲基化修飾基因進行進一步的驗證分析。
　　(3)通過5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化了解順鉑耐藥膀胱癌細胞

3、生物學(xué)的作用;并對細胞生物學(xué)指標進行檢測。
　　(4)采用5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化了解逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥膀胱癌細胞的分子機制:利用real time-PCR及western blot方法,對T24/DDP及經(jīng)5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化處理T24/DDP細胞中關(guān)鍵基因及其蛋白的表達進行分析。
　　結(jié)果:
　　(1)成功建立順鉑耐藥的膀胱癌細胞(T24/DDP):DDP敏感性實驗表明,在20ug/ml濃度的DDP處理下

4、,T24細胞死亡率接近100％,而同樣濃度下順鉑耐受的細胞株亞型T24/DDP細胞的死亡率則是30%。細胞生長曲線表明,T24與T24/DDP細胞的倍增時間分別為72.5和90.2小時。細胞形態(tài)學(xué)觀察表明,T24與T24/DDP細胞形態(tài)學(xué)無明顯差異。細胞周期分析表明,T24/DDP細胞中G0/G1期細胞比例顯著增加,G2/M期細胞下降。
　　(2)順鉑耐藥膀胱癌細胞DNA甲基化差異基因篩選:利用DNA甲基化譜芯片對T24及T24/

5、DDP兩個細胞系的基因組DNA甲基化譜進行分析,發(fā)現(xiàn)1120個甲基化差異位點;并篩選出40個高甲基化,18個低甲基化修飾基因。然后通過real time-PCR方法對該58個差異甲基化修飾基因的表達進行了分析,發(fā)現(xiàn)其中30個基因的表達有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)合文獻資料,又篩選出和本研究相關(guān)基因20個,采用MSP法,對這些基因的甲基化修飾在細胞水平上又進行了驗證分析,最終篩選出與甲基化譜芯片結(jié)果一致的15種基因,包括14種高甲基化和1種低甲基化修

6、飾基因。
　　(3)5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化對順鉑耐藥膀胱癌細胞的生物學(xué)作用:經(jīng)去甲基化處理后,之前發(fā)現(xiàn)的14種高甲基化修飾差異基因中的7種基因的高甲基化修飾被改變:ABCC6,CCNA1,HPP1,ITGA4,RASSF1A,RUNX3,TMS1。同時去甲基化處理后,T24/DDP細胞對于順鉑的敏感性顯著提高、細胞凋亡比例增加、S期細胞比例顯著增加。
　　(4)5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥膀胱癌細胞的分

7、子機制研究:利用real time-PCR和western blot方法的分析結(jié)果表明,上述7種基因(ABCC6,CCNA1,HPP1,ITGA4,RASSF1A,RUNX3,TMS1),經(jīng)5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化處理后,其mRNA及蛋白的表達水平顯著增加。
　　結(jié)論:
　　(1)順鉑濃度梯度遞增法所建立的T24/DDP細胞株對順鉑具有很好的耐受性,可以作為體外模型用于順鉑耐藥機制的研究。
　　(2)膀胱癌細胞發(fā)