彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中Notch2受體截短突變的生物學(xué)功能研究.pdf

1、Notch2是Notch受體家族的一員，它是該家族中促進(jìn)B細(xì)胞實現(xiàn)功能的主要受體。Notch2在淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展中具有多種生物學(xué)功能，這些功能是通過轉(zhuǎn)錄激活Notch2靶基因(如核因子kappaB，Nuclear factor kappa B，NF-κB)實現(xiàn)的。令人感興趣的是，Notch信號通路和NF-κB信號通路之間具有復(fù)雜的相互作用，Notch2能影響NF-κB的表達(dá)，而作為反饋NF-κB也能影響Notch2及其信號通路成員的表達(dá)

2、。因為Notch2是一種高保守的受體蛋白，所以Notch2突變在淋巴瘤中比較罕見。直到最近，人們才在一些B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)中發(fā)現(xiàn)Notch2突變，比如彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)和邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)。DLBCL是最常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)亞型，它以其組織學(xué)異質(zhì)性和臨床表現(xiàn)異質(zhì)性而聞名。目前，DLBCL的研究熱點仍為尋找更好的DLBCL分類方法和治療策略，這些研究均以在DLBCL發(fā)生發(fā)展過程中啟重要作用的原癌

3、基因（如Notch2）為基礎(chǔ)。本研究旨在探索在DLBCL中Notch2受體突變的作用。
　　首先，在DLBCL核酸樣本中，我們對Notch2基因的26號外顯子和34號外顯子進(jìn)行DNA測序分析。我們在3例DLBCL樣本（共69例）中發(fā)現(xiàn)了一個相同的突變，它發(fā)生于PEST（proline-，glutamic acid-，serine-and threonine-rich）結(jié)構(gòu)域。該突變位于Notch2 cDNA序列的7308位(G/A

4、)，它能使色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子，從而使Notch2受體C末端的PEST結(jié)構(gòu)域缺失部分結(jié)構(gòu)。攜帶該突變的3例DLBCL樣本表達(dá)類似的免疫表型，均為Notch2+P50+P65+Ki67+，這些指標(biāo)預(yù)示著這類DLBCL可能具有比較活躍的細(xì)胞增殖能力。根據(jù)上述測序結(jié)果，我們構(gòu)建Notch2野生型和突變型的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞株和淋巴瘤細(xì)胞株，包括DLBCL細(xì)胞株（Pfeiffer、OCI-ly3和OCI-ly6）和Burkit

5、t's淋巴瘤（Raji、Ramos、Daudi和Namalwa）。其次，通過增殖實驗、細(xì)胞周期阻滯與釋放實驗以及細(xì)胞凋亡實驗，我們發(fā)現(xiàn)這類突變的Notch2受體可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，加快細(xì)胞周期進(jìn)程和抑制凋亡。再次，免疫共沉淀和螢光素酶報告基因?qū)嶒灥慕Y(jié)果顯示，相對于野生型的Notch2，突變的Notch2與DNA結(jié)合蛋白RBP-Jκ(recombination signalbinding protein for immunoglobulin

6、 kappa J region，也稱Su(H)、CSL和CBF1）的結(jié)合親和力較強，并且具有更高的轉(zhuǎn)錄活性。另外，通過Western Blot、Real-time PCR和螢光素酶報告基因等實驗，我們發(fā)現(xiàn)Notch2受體突變可以顯著激活NF-κB信號通路。通過增殖實驗，我們還發(fā)現(xiàn)由Notch2突變誘發(fā)的快速細(xì)胞增殖能被PDTC（ammonium pyrrolidinedithiocarbamate，一種NF-κB信號通路抑制劑）完全逆轉(zhuǎn)

7、。最后，Western Blot結(jié)果顯示Notch2 siRNA能調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的表達(dá)水平，而PDTC也能影響Notch2的表達(dá)水平。
　　綜上所述，攜帶Notch2突變的DLBCL可被歸類為一種新的DLBCL亞型，它以活躍的細(xì)胞增殖為特征。PEST截短的Notch2可通過加快細(xì)胞周期進(jìn)程和抑制凋亡來促進(jìn)細(xì)胞增殖。我們從實驗結(jié)果推測，這種由截短的Notch2誘導(dǎo)的快速增殖可能與Notch2信號通路和NF-κB信號通路的異常