大鼠肝缺血再灌注損傷中Hsp70與PARP蛋白協(xié)同作用的研究.pdf

1、目的：通過熱應(yīng)激建立 Hsp70高表達(dá)模型，探討高表達(dá)的Hsp70在大鼠肝缺血再灌注損傷中對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用及與DNA保護(hù)蛋白PARP蛋白相關(guān)關(guān)系。
　　方法：購買健康SD雄鼠35只，隨機(jī)分為5組，分別為H-/P+、H+/P-、H+/P+、PC、NC組。通過熱應(yīng)激刺激熱休克蛋白（Hsp70）的高表達(dá)，槲皮素抑制Hsp70表達(dá)，3-氨基苯甲酰胺（3-AB：3-aminobenzamide）抑制 PARP-1自由表達(dá)，PC（Posit

2、ive control group，陽性對(duì)照組）單純行肝缺血再灌注，NC（Negative control group，陰性對(duì)照組）單純手術(shù)開腹不行肝血管夾閉。Pringle’s法建立SD雄性大鼠肝缺血再灌注模型，取血液學(xué)標(biāo)本檢測 ALT了解肝功能受損情況；取肝臟組織標(biāo)本作 HE染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化檢測標(biāo)本組織中的Hsp70和PARP-1的表達(dá)和定位；Western blot（WB）檢測Hsp70的表達(dá)，TUNEL法檢測肝

3、細(xì)胞凋亡，用專業(yè)圖像分析軟件對(duì)免疫組化及 WB結(jié)果進(jìn)行分析，用SPSS16.0對(duì)所測的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.HE染色：光鏡下可見PC組（陽性對(duì)照組）肝細(xì)胞腫脹明顯，肝細(xì)胞索及肝竇界線不清，肝竇狹窄，肝小葉中央靜脈、肝竇淤血，匯管區(qū)可見中性粒細(xì)胞浸潤；NC組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，小葉中央靜脈、肝細(xì)胞索及肝竇結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，肝竇未見明顯淤血，H+/P+介于兩者之間。
　　2.血清ALT

4、檢測：PC組與H-/P+、H+/P-、H+/P+、NC組比較有顯著性差異,高于其他組，P<0.01；H+/P+較 PC、H-/P+、H+/P-低，P<0.01；H+/P-同 H-/P+比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，H+/P-低于H-/P+，P<0.01。
　　3.Hsp70免疫組化染色：染色信號(hào)主要位于細(xì)胞漿，少量出現(xiàn)在細(xì)胞核中，棕黃色為陽性標(biāo)記細(xì)胞，陽性細(xì)胞主要分散于小葉靜脈周圍。H+/P+、H+/P-組無顯著性差異，H-/P+組低于前兩組

5、Hsp70的表達(dá)，表示造模成功。
　　4.PARP-1免疫組化染色：棕黃色顆粒主要位于細(xì)胞核，染色細(xì)胞分散在中央靜脈周圍，統(tǒng)計(jì)分析顯示H+/P-組與H+/P+、H-/P+、PC、NC組比較，PARP-1表達(dá)有顯著性差異, H+/P+,H-/P+組PARP-1的表達(dá)無顯著性差異，造模成功。
　　5.WB檢測：WB印證了免疫組化所測的結(jié)果，更進(jìn)一步明確Hsp70的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)分析示H+/P-組與H+/P+組比較無顯著性差異；H

6、-/P+組與PC組比較無顯著性差異,兩者皆P>0.05；H+/P-組及H+/P+組分別與其他組比較，都有顯著性差異，較其他組表達(dá)明顯增多，P<0.01；NC組與其他四組比較有顯著性差異，明顯較其他四組低，P<0.01,熱應(yīng)激促進(jìn)Hsp70的高表達(dá)，槲皮素達(dá)到了抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)Hsp70過表達(dá)的效果。
　　6.TUNEL染色：光鏡下顯示凋亡細(xì)胞主要位于中央靜脈周圍，細(xì)胞核致密深染成棕黃色，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示凋亡陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù) H+/P-組較

7、H-/P+組明顯減少，P<0.05；H+/P+較 H-/P+、H+/P-及 PC組明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。PC組較其它幾組比較凋亡細(xì)胞最多，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.結(jié)果表明Hsp70減少HIRI中肝細(xì)胞凋亡，減輕肝功能的損害；
　　2.PARP-1可減少HIRI所致的肝細(xì)胞凋亡，發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用；
　　3.HIRI中當(dāng)細(xì)胞中PARP-1蛋白存在時(shí)更有利于Hsp70發(fā)揮細(xì)胞