CTP-β-gal融合蛋白在體內(nèi)和體外的分布和動(dòng)力學(xué)的研究.pdf

1、目的：胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)肽（cytoplasmic transduction peptide，CTP），作為一種生物載體，能為一些由于胞漿蛋白缺陷而致的疾病提供新的治療策略。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)CTP融合BCR/ABL寡聚化區(qū)域（oligomerization domain，OD）在慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞中對BCR/ABL癌蛋白有靶向的治療作用。本課題擬通過評價(jià)CTP-β-gal融合蛋白在BaF3-P210細(xì)胞中的胞漿定位和酶活性能力，并測定

2、融合蛋白在小鼠體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)和組織分布，以此來探討CTP-OD-HA融合蛋白在臨床運(yùn)用的可行性。 方法：將lacZ、CTP基因依次插入到質(zhì)粒pET32a（+），通過轉(zhuǎn)化、IPTG誘導(dǎo)融合蛋白CTP-β-gal表達(dá)，親和層析純化目的蛋白，最后Western blot鑒定純化后的目的蛋白。融合蛋白CTP-β-gal轉(zhuǎn)導(dǎo)BaF3-P210細(xì)胞，通過激光共聚焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)分析和X-gal原位染色分析融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和活性能力

3、。體內(nèi)通過尾靜脈注射雌性Balb/c小鼠，于注射后15min，1h，3h和24h收集肝臟、脾臟、腎臟、肺和腦組織。X-gal原位染色和定量酶活性分析檢測CTP-β-gal融合蛋白在各種組織中的分布情況。 結(jié)果：成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a（+）-CTP-lacZ，純化和Western blot鑒定了重組融合蛋白CTP-β-gal。激光共聚焦顯微鏡和免疫組織化學(xué)檢測分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白CTP-β-gal在BaF3-P210細(xì)胞中有

4、很強(qiáng)的胞漿定位能力，且具有較高的酶活性能力。β-gal酶活性定量分析Balb/c小鼠各組織，發(fā)現(xiàn)CTP-β-gal融合蛋白酶活性在大多數(shù)組織中15min達(dá)高峰，僅腦組織是24h達(dá)高峰。 結(jié)論：本研究闡明了融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)BaF3-P210細(xì)胞和靜脈注射Balb/c小鼠后，CTP融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和酶活性能力以及在小鼠體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)和組織分布情況，為CTP-OD-HA治療CML提供了合理的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為CTP融合蛋白胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮