中國漢族單純型發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙家系的基因定位與克隆.pdf

1、目的: 本課題共收集了6個中國漢族PKD家系，將其與國內(nèi)外已報道的PKD家系進行對比研究，深入挖掘中國漢族PKD家系自身特殊的臨床特點，并選擇具有代表性的家系進行基因定位與克隆研究，定位中國漢族PKD新的致病基因位點，期待克隆出PKD的致病基因。 方法: 1)臨床研究：綜合已收集的6個PKD家系和中國已報道的12個PKD家系，與國外的42個PKD家系進行臨床分析以及發(fā)病年齡、嚴重程度的配對t檢驗和wilcoxon

2、符號秩和統(tǒng)計學(xué)分析。 2)基因定位：選擇家系結(jié)構(gòu)好、患病人數(shù)多的家系A(chǔ)進行基因定位研究。首先選擇24個微衛(wèi)星位點對涵蓋EKD1和EKD2的整條16號染色體進行排除定位：在排除了家系與16號染色體的連鎖關(guān)系后，利用商業(yè)化的ABI全基因組連鎖試劑盒Linkage Mapping Setv.2.5-MD10進行SIR全基因組掃描，并在全掃的陽性區(qū)域內(nèi)進一步增加微衛(wèi)星位點進行精細定位；為了進一步驗證STR掃描的結(jié)果，同時更加深入的挖掘該

3、家系所包含的遺傳信息，利用全基因組Linkage-12 SNP芯片對家系進行的再次掃描和定位，并采用Genehunter-2-Iocus軟件對陽性區(qū)域進行2個致病位點相互作用檢驗。 3)候選基因克?。翰捎霉δ?候選克隆的策略，篩選4個已知基因(KCNG3、SLC8A1、PRKCE和FGF12基因)作為候選基因進行測序和突變分析。 結(jié)果: 1)臨床表型上，中國單純型PKD家系存在發(fā)病年齡逐代提前和(或)嚴重程度加重

4、的遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象：統(tǒng)計學(xué)上，中國單純型PKD家系代與代之間的平均年齡差為5.2歲，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(配對t檢驗和Wilcoxon符號秩檢驗P值均<0.0001)，而復(fù)雜型PKD發(fā)病年齡并無顯著差異(P>0.01)。 2)參數(shù)和非參數(shù)分析排除了該家系的致病基因與16號染色體存在連鎖關(guān)系。STR全基因組掃描在D3S1580處獲得了最大的兩點LOD值1.75(θ=0)，其最大多點LOD值和NPL值分別為1.60和4.64( P=0.0

5、04)，將這個PKD家系的致病基因位點初步定位于D3S1262和D3S1311之間的區(qū)域。進一步的精確定位在D3S3669處得到最大的LOD值2.82(θ=0)，NPL值9.83(P<0.0001);單體型分析將致病基因定位于D3 S1314和D3S1265之間約10.2 cM大小的區(qū)域，對應(yīng)NCBI的Marshfield圖譜，相當(dāng)于3q28-29的區(qū)域。全基因組SNP芯片掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)除3q28-29外，還存在另一個連鎖信號較強的區(qū)域2

6、p21-22，其位置分別位于2號染色體rs1509562至rs1016607之間約7.18cM(LOD值為2.35；NPL值為5.30；P<0.00001)和3號染色體rs10937369至rs711995之間約13.78cM(LOD值為2.39；NPL值為5.74;P<0.00001)的區(qū)域。兩位點相互作用檢驗結(jié)果在基于倍增模型的前提下得到最大的two-locus LOD值3.81，同時最大two-locus NPL值也升至7.81(

7、P=0.0006)，提示PKD可能同時存在兩個致病基因位點2p21-22和3q28-29。 3)在對4個候選基因中的測序分析中發(fā)現(xiàn)了8個DNA序列變異，其中有兩個DNA序列的改變導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生變化，但 未見與該PKD家系的表型發(fā)生共分離，說明這8個DNA序列變異均為單核苷酸多態(tài)，從而排除了這4個候選基因為該PKD家系致病基因的可能。 結(jié)論: 1)發(fā)作性運動誘發(fā)性運動障礙可分為單純型和復(fù)雜型兩種亞型