蛋白攝入水平對早產(chǎn)學(xué)習(xí)認(rèn)知能力及mTOR-S6K通路的影響.pdf

1、背景：隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是危重新生兒救治水平的提高，早產(chǎn)兒，特別是出生體重低于1500g的極低/超低出生體重兒(Very Low BirthWeight/Extremely Low Birth Weight，VLBW/ELBW)的存活率明顯提高。雖然早產(chǎn)兒存活率大大提高，但神經(jīng)發(fā)育障礙并未成比例的下降。早產(chǎn)兒中腦性癱瘓(cerebral palsy，CP)的發(fā)生率呈逐年上升趨勢。存活早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育的遠(yuǎn)期問題主要為腦性癱瘓、認(rèn)知

2、能力障礙、智力障礙以及視聽覺缺陷。即使有部分早產(chǎn)兒并無以上的損傷，但卻表現(xiàn)為隱性殘疾（如:情緒不受控、注意力無法集中、閱讀書寫能力差等。早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育障礙與窒息、病理性黃疸、顱內(nèi)出血、缺氧缺血性腦病等早產(chǎn)兒并發(fā)癥有關(guān)外，早產(chǎn)兒營養(yǎng)對神經(jīng)發(fā)育結(jié)局的影響是備受各國學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)之一，如何做到最佳的營養(yǎng)支持方案這一直是醫(yī)學(xué)界丞待解決的問題。Lucas教授提出“營養(yǎng)程序化”(nutritional programming)的概念，即在發(fā)育的關(guān)鍵

3、期或敏感期的營養(yǎng)狀況將對機(jī)體或各器官功能產(chǎn)生長期乃至終生的影響，其臨床研究也表明，在關(guān)鍵期給予早產(chǎn)配方奶（高蛋白）更有利于神經(jīng)發(fā)育。Singhal等學(xué)者則發(fā)現(xiàn)，雖然強(qiáng)化營養(yǎng)配方喂養(yǎng)組比起標(biāo)準(zhǔn)配方喂養(yǎng)組神經(jīng)發(fā)育更優(yōu)，但青春期時胰島素抵抗和高血壓等代謝性疾病的發(fā)生率卻更高。大腦發(fā)育是個漫長而又極其復(fù)雜的過程，涉及神經(jīng)細(xì)胞的分化、增殖，神經(jīng)滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、增殖，腦及腦區(qū)的形成等，不同的發(fā)育階段對營養(yǎng)有不同的需求，除“關(guān)鍵期”營養(yǎng)干預(yù)可影響早產(chǎn)

4、幾神經(jīng)發(fā)育外，是否在“關(guān)鍵期”后實(shí)施營養(yǎng)干預(yù)也能影響早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育，并且還能降低早產(chǎn)兒追趕生長帶來的負(fù)面效應(yīng)，這是一個非常值得探討的課題。哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyoin，mTOR)是進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶(plosphatidylinOsitol3-kinase-related kinase，PIKK)蛋白質(zhì)家族的成員，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)

5、感受細(xì)胞外營養(yǎng)、能量水平以及生長因子等信號變化。mTOR不同結(jié)構(gòu)域和不同蛋白結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)主要形成兩種復(fù)合物，即mTOR-Raptor復(fù)合物(mTORC1)和mTOR-Richtor復(fù)合物（mTORC2）。正常情況下，生長因子（如胰島素、胰島素樣生長因子、表皮生長因子等）誘導(dǎo)mTOR的活化是通過激活PI3K實(shí)現(xiàn)的。PI3K可磷酸化3-磷酸肌醇，磷酸化的3-磷酸肌醇(PI3Ps)與Akt的PH區(qū)域連接導(dǎo)致Akt轉(zhuǎn)位至漿膜，從而與磷酸肌醇依賴

6、性激酶1(PDKI)接觸。PDKI負(fù)責(zé)Akt的磷酸化，從而激活A(yù)kt。激活的Akt可磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體2(tuberoussclerosiscomplex2，TSC2)并減弱后者對mTORC1的抑制作用。與生長因子激活通路不同，營養(yǎng)信號激活通路主要經(jīng)過AMPK途徑。AMPK受細(xì)胞內(nèi)ATP/AMP的調(diào)節(jié)當(dāng)ATP/AMP比例下調(diào)時.AMPK被激活，活化的AMPK可磷酸化并激活TSC1/TSC2二聚體，抑制mTORC1，反之亦然?；罨膍

7、TORC1進(jìn)一步磷酸化S6K和4EBP，從而參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始、核糖體生物合成、細(xì)胞周期調(diào)控等。近年來，一系列的研究發(fā)現(xiàn)mTOR相關(guān)信號通路與突觸可塑性、學(xué)習(xí)、記憶功能，神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變及攝食等密切相關(guān)。mTOR信號通路在海馬的學(xué)習(xí)、記憶提取和記憶鞏固的蛋白翻譯過程中有著重要作用;mTOR信號通路是長時程電位晚期成分形成的必要條件;脂肪貯存充足時，mTOR促進(jìn)來普汀的產(chǎn)生，來普汀依次傳遞能量過剩的信息給中樞神經(jīng)系，抑制攝食和

8、促進(jìn)能量消耗。然而目前的研究多集中在成年相關(guān)疾病，mTOR與新生兒特別是早產(chǎn)兒的生長發(fā)育相關(guān)研究較少，不同營養(yǎng)條件下早產(chǎn)兒mTOR通路的活性及其生長發(fā)育的影響還有待我們探討。現(xiàn)行研究多集中在成年相關(guān)疾病，mTOR與新生兒特別是早產(chǎn)兒的生長發(fā)育相關(guān)研究較少，深入研究不同營養(yǎng)條件下mTOR通路的活性改變對于探討早產(chǎn)兒生長發(fā)育尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，優(yōu)化早產(chǎn)兒營養(yǎng)支持方案具有重要意義。
　　 目的：通過建立早產(chǎn)大鼠模型，斷奶后給予不同的蛋

9、白質(zhì)飼料喂養(yǎng)至6周和8周，并通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變，并通過免疫組織化學(xué)染色、蛋白印跡法(western blot)技術(shù)分析mTOR/S6K通路活性的變化，探討關(guān)鍵期后不同的蛋白攝入水平對早產(chǎn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其可能機(jī)制，為優(yōu)化早產(chǎn)兒營養(yǎng)支持方案提供依據(jù)。
　　 方法：過剖宮產(chǎn)法獲得新生SD早產(chǎn)大鼠，仔鼠由代乳母鼠哺乳至21日齡。將斷奶后的早產(chǎn)SD仔鼠和足月SD仔鼠采用機(jī)數(shù)字法分為6組:早產(chǎn)標(biāo)

10、準(zhǔn)蛋白組(A)、足月標(biāo)準(zhǔn)蛋白組(B)、早產(chǎn)低蛋白組(C)、足月低蛋白組(D)、早產(chǎn)高蛋白組(E)、足月高蛋白組(F)，每組大鼠34只。從第22日齡起，標(biāo)準(zhǔn)蛋白組、低蛋白組和高蛋白組給予標(biāo)準(zhǔn)蛋白飼料（含18％蛋白質(zhì)）、低蛋白飼料（含8％蛋白質(zhì)）和高蛋白飼料（含30％蛋白質(zhì)）喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每組大鼠分別在第6周和第8周進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變。同期免疫組織化學(xué)法觀察海馬mTOR分布。Western blot觀察

11、海馬mTOR、p-mTOR(Ser2448)、p70S6K、p-p70S6K(Thr389)、4EBP1表達(dá)和活性。
　　 結(jié)果：⑴6周齡大鼠逃避潛伏期比較:各組大鼠6周齡時定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的比較結(jié)果顯示，足月大鼠（足月高蛋白組、足月低蛋白組和足月標(biāo)準(zhǔn)蛋白組）的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短(P＜0.05)，并且每天縮短的速度較為穩(wěn)定，而早產(chǎn)大鼠（早產(chǎn)高蛋白組、早產(chǎn)低蛋白組和早產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白組）的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)的變化

12、趨勢與對足月大鼠不同，呈現(xiàn)出先快后慢的變化趨勢。早產(chǎn)大鼠在前3天的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短(P＜0.05)，但是在接下來的第4天其逃避潛伏期與第3天基本接近，變化不顯著（P＞0.05）。組間兩兩比較顯示，與足月大鼠比較，早產(chǎn)大鼠前3天的逃避潛伏期無顯著性差異，第4天逃避潛伏期，足月高蛋白組大鼠明顯低于早產(chǎn)高蛋白組大鼠(P＜0.05)。說明6周齡的足月大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力強(qiáng)于早產(chǎn)大鼠。⑵早產(chǎn)大鼠6周齡和8周齡的逃避潛伏期比較:早產(chǎn)大鼠

13、8周齡時定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的比較結(jié)果顯示，其逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短(P＜0.05)，并且每天縮短的速度較為穩(wěn)定，而在6周齡時，早產(chǎn)大鼠的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)的變化趨勢與8周齡時不同，呈現(xiàn)出先快后慢的變化趨勢。6周齡早產(chǎn)大鼠在前3天的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短，但是在接下來的第4天其逃避潛伏期與第3天基本接近，變化不顯著(P＞0.05)。不同周齡間兩兩比較顯示，與6周齡早產(chǎn)大鼠比較，8周齡早產(chǎn)大鼠前3天的逃避潛伏期無

14、顯著性差異:第4天逃避潛伏期，8周齡早產(chǎn)高蛋白組大鼠明顯低于6周齡早產(chǎn)高蛋白組大鼠（P＜0.05）。⑶各組大鼠6周齡時空間探索實(shí)驗(yàn)的比較:在予蛋白含量相同飼料飼養(yǎng)的情況下，6周齡早產(chǎn)大鼠的原平臺所在象限時間和原平臺所在象限路程占總路程的百分比均明顯少于6周齡足月大鼠，差異具有顯著性(P＜0.05)。⑷不同蛋白飼料對6周齡足月大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響:不同蛋白飼料組足月大鼠6周齡時，各組大鼠的原平臺所在象限時間和原平臺所在象限路程占總路程的

15、百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。⑸不同蛋白飼料對8周齡足月大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響:不同蛋白飼料組足月大鼠8周齡時，各組大鼠的原平臺所在象限時間和原平臺所在象限路程占總路程的百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。⑹早產(chǎn)大鼠6周齡和8周齡時空間探索實(shí)驗(yàn)的比較:在予蛋白含量相同飼料飼養(yǎng)的情況下，8周齡早產(chǎn)高蛋白組大鼠的穿越原平臺時間和原平臺所在象限時間占總時間的百分比均明顯大于6周齡早產(chǎn)高蛋白組大鼠，差異具有顯著性（P＜0.05）

16、。⑺同種蛋白飼料對6周齡大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR表達(dá)的影響:免疫組化結(jié)果顯示，mTOR免疫陽性細(xì)胞主要分布于大腦海馬CA1、CA3和齒狀回(DG)。其中海馬區(qū)CA1起始部及CA3起始部，陽性細(xì)胞相對海馬其它部位多，著色更深。高倍鏡下，mTOR陽性細(xì)胞邊界清晰，主要在胞漿著色。同種蛋白飼料6周齡各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR免疫陽性細(xì)胞計數(shù)，6周齡足月各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR陽性細(xì)胞均比早產(chǎn)組多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意

17、義(P＜0.05)。⑻不同蛋白飼料對6周齡足月大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR表達(dá)的影響:6周齡各組足月大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR免疫陽性細(xì)胞計數(shù)差異并不明顯(P＞0.05)。⑼同蛋白飼料對8周齡大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR表達(dá)的影響:免疫組化結(jié)果顯示，mTOR免疫陽性細(xì)胞主要分布于大腦海馬CA1、CA3和齒狀回(DG)。其中海馬區(qū)CA1起始部及CA3起始部陽性細(xì)胞相對海馬其它部位多，著色更深。高倍鏡下，mTOR陽性細(xì)胞邊界清

18、晰，主要在胞漿著色。同種蛋白飼料8周齡各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR免疫陽性細(xì)胞計數(shù)中，8周齡足月低蛋白組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR陽性細(xì)胞均比早產(chǎn)低蛋白組多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。8周齡標(biāo)準(zhǔn)蛋白飼料、高蛋白飼料足月組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR陽性細(xì)胞與同齡同飼料喂養(yǎng)早產(chǎn)組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR陽性細(xì)胞的差異不明顯(P＞0.05)。⑽早產(chǎn)大鼠6周齡和8周齡時mTOR表達(dá)的比較:在予蛋白含量相同飼

19、料飼養(yǎng)的情況下，與6周齡早產(chǎn)大鼠比較，8周齡早產(chǎn)大鼠海馬CA1和CA3區(qū)mTOR陽性細(xì)胞增多，差異具有顯著性(P＜0.05)，其中8周齡早產(chǎn)高蛋白組mTOR陽性細(xì)胞增加較為顯著。⑾6周齡大鼠海馬mTOR信號通路的變化：早產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(PS)、早產(chǎn)低蛋白(PL)、早產(chǎn)高蛋白(PH)組6周齡大鼠在海馬中的p-p70S6K(Thr389)的表達(dá)受嚴(yán)重抑制甚至不表達(dá)；早產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(PS)、早產(chǎn)低蛋白(PL)、早產(chǎn)高蛋白(PH)組6周齡大鼠在海馬中

20、的4EBP1的表達(dá)比同齡足月標(biāo)準(zhǔn)蛋白(PS)、足月低蛋白(PL)、足月高蛋白(PH)組的弱；早產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白、早產(chǎn)低蛋白、早產(chǎn)高蛋白組、足月標(biāo)準(zhǔn)蛋白(PS)、足月低蛋白、足月高蛋白組6周齡大鼠海馬中的mTOR、p-mTOR(Ser2448)、p70S6K的表達(dá)差異不大。⑿6周，8周齡各組大鼠海馬p-p70S6K/Actin免疫活性比值比較：6周周齡各組大鼠海馬p-p70S6K/Actin免疫活性比值比較，結(jié)果顯示，早產(chǎn)各組大鼠海馬p70S6

21、K磷酸化水平較同齡足月各組大鼠海馬p70S6K磷酸化水平明顯降低，以胎齡和蛋白水平為主要影響因素的雙向ANOVA分析提示胎齡有顯著性作用（F胎齡=8.233，P=0.014＜0.05）；8周周齡各組大鼠海馬p-p70S6K/Actin免疫活性比值比較，結(jié)果顯示，高蛋白組（早產(chǎn)高蛋白組合足月高蛋白組）大鼠海馬p70S6K磷酸化水平顯著升高，以胎齡和蛋白水平為主要影響因素的雙向ANOVA分析提示蛋白水平有顯著性作用（F蛋白水平=4.13，P

22、=＜0.05）。高蛋白組與低蛋白組的LSD事后檢驗(yàn)P=0.021＜0.05，高蛋白組與標(biāo)準(zhǔn)蛋白組的LSD事后檢驗(yàn)P=0.042＜0.05。
　　 結(jié)論：①在大鼠早期生長發(fā)育過程中，早產(chǎn)可能嚴(yán)重影響大鼠大腦的功能，在大腦發(fā)育關(guān)鍵期后的發(fā)育過程中，短時間加強(qiáng)營養(yǎng)的補(bǔ)給仍不能彌補(bǔ)早產(chǎn)對大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力造成的影響，其學(xué)習(xí)記憶能力明顯差于足月大鼠。②在隨后的生長發(fā)育過程中，高蛋白組早產(chǎn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到恢復(fù)并能追趕上足月大鼠。經(jīng)過長時