依布硒誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞脹亡及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　依布硒(Ebselen2-phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one)是一種具有抗腫瘤活性的含硒有機(jī)化合物,目前其抗腫瘤作用針對(duì)不同類型腫瘤是否具有選擇性鮮見報(bào)道,其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的病理類型尚存爭(zhēng)議,所涉及分子機(jī)制也不清楚。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)通過CCK8法檢測(cè)Ebselen對(duì)不同種類腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞活力的影響發(fā)現(xiàn)血液來源腫瘤多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma MM)細(xì)胞株U266

2、和RPMI8226對(duì)Ebselen的抗腫瘤活性較其他實(shí)體腫瘤細(xì)胞株更加敏感。MM是一種B細(xì)胞來源的惡性漿細(xì)胞腫瘤,目前臨床治療療效差,預(yù)后不良,在我國(guó)發(fā)病率將逐年增高,因此針對(duì)MM的新藥研發(fā)具有重要意義。
　　研究目的:
　　本研究的主要目的是確定依布硒誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞死亡的病理類型,并嘗試探討其中的分子機(jī)制,為依布硒應(yīng)用于多發(fā)性骨髓瘤治療提供部分基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.為了確定依布硒誘導(dǎo)多發(fā)

3、性骨髓瘤細(xì)胞死亡的病理類型,我們首先通過光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察依布硒處理后細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化,然后利用臺(tái)盼藍(lán)染色和Annexin V–propidium iodide(AV–PI)雙染檢測(cè)細(xì)胞通透性的改變,最后利用Hoechst染色及彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)依布硒對(duì)細(xì)胞核及DNA的影響。
　　2.為了進(jìn)一步探討依布硒誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞死亡的分子機(jī)制,我們利用熒光探針檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species

4、ROS)的含量和細(xì)胞線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential MMP)的變化。
　　3.通過 Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)依布硒對(duì)細(xì)胞內(nèi) Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素 C、cleaved-Caspase9等凋亡相關(guān)蛋白的影響,通過 Real-time PCR及 Western-blot檢測(cè)Thioredoxin1(Trx1)基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量的變化,而后又通過 EMSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)依布硒

5、對(duì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α和NF-kb轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　4.最后應(yīng)用不同類型抗氧化劑預(yù)處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞后檢測(cè)抗氧化劑對(duì)依布硒上述作用的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.依布硒作用于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞后,細(xì)胞膜出現(xiàn)圓形泡狀突起并逐漸增大,胞漿高度空泡化,多種細(xì)胞器明顯腫脹呈氣球樣;臺(tái)盼藍(lán)染色和PI染色均陽(yáng)性提示細(xì)胞膜屏障作用消失,通透性增加,胞核染色質(zhì)凝聚、碎裂,DNA鏈斷裂。
　　2.經(jīng)依布硒處理后多發(fā)性骨

6、髓瘤細(xì)胞內(nèi) ROS水平升高,線粒體膜電位丟失;對(duì)凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白減少且從胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位,細(xì)胞色素C從線粒體釋放至胞漿,Caspase9蛋白未被激活;Trx1在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平上都明顯下降;HIF-1α和NF-kb的轉(zhuǎn)錄活性也明顯降低。
　　3.通過實(shí)驗(yàn)我們還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用不同種類抗氧化劑預(yù)處理細(xì)胞能夠拮抗或部分拮抗依布硒的上述作用。
　　結(jié)論:
　　1、依布硒誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞死亡的病理類型