流感病毒核酸測(cè)定分析前變量和生物危害暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.pdf

1、背景:基于PCR的核酸測(cè)定技術(shù)已成為流感病毒學(xué)監(jiān)測(cè)和診斷的首選方法。然而除了核酸測(cè)定方法、測(cè)定試劑、使用的引物和探針外,核酸測(cè)定分析前的樣品儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)以及核酸分離純化方法等變量也對(duì)核酸測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生重要影響。此外,核酸測(cè)定過(guò)程中潛在的生物危害也是核酸測(cè)定技術(shù)實(shí)際應(yīng)用必須考慮的因素。
　　目的:
　　1)為提高核酸檢測(cè)樣本的制備效率,將基于磁珠技術(shù)的自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)Maxwell16 System應(yīng)用于流感病毒核酸提取并分析該方

2、法對(duì)實(shí)時(shí)RT-PCR的影響,以評(píng)估該自動(dòng)系統(tǒng)用于流感病毒核酸檢測(cè)的適宜性。
　　2)了解不同核酸提取試劑的裂解緩沖液穩(wěn)定流感病毒RNA的能力,為將裂解緩沖液用作流感病毒核酸檢測(cè)樣品的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　3)測(cè)定常用的病毒核酸提取方法的裂解緩沖液滅活流感病毒的能力,以評(píng)估流感病毒核酸提取過(guò)程中的生物危害暴露風(fēng)險(xiǎn)。
　　方法:
　　1)Maxwell16 System提取系列稀釋的流感病毒培養(yǎng)液以及咽拭子、

3、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、人和禽糞便標(biāo)本中的流感病毒核酸,以CDC開(kāi)發(fā)的實(shí)時(shí)RT-PCR(real-time RT-PCR,rRT-PCR)方法檢測(cè)提取物,所獲結(jié)果與經(jīng)典的基于硅膠柱層析的手工核酸提取試劑QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAamp Kit)提取所獲得的結(jié)果相比較,分析Maxwell16 System提取流感病毒核酸的敏感性、線性、重復(fù)性以

4、及從多種臨床和環(huán)境樣本中提取流感病毒核酸的效率。
　　2)分別以QIAamp Kit中的Buffer AVL和Maxwell16 System中的Lysis Solution兩種裂解緩沖液處理流感病毒溶液,處理后的裂解緩沖液/病毒混合物分別保存于室溫、4℃和-20℃或者進(jìn)行多次凍融,以rRT-PCR分析病毒RNA量的變化,以擴(kuò)增流感病毒基因組RNA第7節(jié)段全長(zhǎng)的傳統(tǒng)RT-PCR(conventional RT-PCR,cRT-PC

5、R)評(píng)估病毒RNA的完整性。
　　3)以Maxwell16 System的Lysis Solution、QIAamp Kit的Buffer AVL和改良的異硫氰酸胍法試劑的RNA提取試劑A液(RNA Extraction Reagent A,ERA)等三種常用的病毒RNA提取方法的裂解緩沖液處理高滴度的流感病毒,系列對(duì)數(shù)稀釋病毒處理液后接種于MDCK細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng),以倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),血凝實(shí)驗(yàn)確定流感病毒存在與否。

6、r>　　結(jié)果:
　　1)與QIAamp Kit比較,Maxwell16 System的標(biāo)準(zhǔn)程序(Maxwell16-S)有良好的線性、重復(fù)性以及更高的分析敏感性;Maxwell16-S程序從咽拭子和BALF標(biāo)本中可分離到更多的病毒RNA和/或更少的PCR抑制物,然而在糞便標(biāo)本中的效率剛好相反,不能獲得滿意的效果;通過(guò)改良Maxwell16程序,Maxwell16 System清除糞便基質(zhì)中PCR抑制物的能力得到改善,提取禽糞便標(biāo)本

7、病毒核酸的效率與QIAamp方法可比,而提取人糞便標(biāo)本中病毒核酸的效率仍不及QIAamp方法。
　　2)Lysis Solution和Buffer AVL兩種裂解緩沖液處理的病毒樣品,-20℃放置160天和凍融5次均仍能收獲量沒(méi)有明顯減少的完整的病毒基因組RNA;室溫條件下,病毒RNA降解明顯,兩緩沖液處理后放置3天均不能確定收獲到完整的流感病毒RNA分子;4℃條件下保存一定時(shí)間能收獲到全長(zhǎng)的流感病毒RNA分子;而在4℃和室溫條件

8、下,Buffer AVL處理較Lysis Solution處理后樣品中的病毒RNA降解速度更快。
　　3)Lysis Solution、Buffer AVL和ERA三種裂解緩沖液處理病毒所獲得的裂解溶液/病毒混合物,通過(guò)對(duì)數(shù)稀釋結(jié)果發(fā)現(xiàn),在低稀釋度時(shí)和試劑對(duì)照一樣,接種24h內(nèi)引起MDCK細(xì)胞的完全死亡;在高稀釋度時(shí),三種裂解溶液/病毒混合物沒(méi)有引起 MDCK細(xì)胞病變,且培養(yǎng)物血凝實(shí)驗(yàn)陰性,而同時(shí)設(shè)置的病毒對(duì)照出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變

9、,且培養(yǎng)物血凝實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。
　　結(jié)論:
　　1)Maxwell16 System結(jié)合rRT-PCR可以用于流感病毒的定量和定性測(cè)定;其清除不同樣本基質(zhì)中的PCR抑制物的能力不同,從而對(duì)rRT-PCR檢測(cè)不同樣本的敏感性產(chǎn)生影響,使其適用于咽拭子、BALF和禽糞標(biāo)本中流感病毒RNA的提取,而不適于人糞便標(biāo)本病毒核酸的提取;對(duì)于一些復(fù)雜的樣本基質(zhì),適當(dāng)?shù)販p少樣本輸入量可以提高檢出。
　　2)不同的核酸提取試劑的裂解緩沖液用作

10、流感病毒樣本的保存劑都有助于病毒RNA的穩(wěn)定性,可抵抗多次凍融對(duì)病毒RNA的損傷,冷藏或冷凍的低溫條件下(特別是-20℃或更低溫度)較長(zhǎng)時(shí)間仍可收獲到完整的流感病毒基因組RNA;但不同方法學(xué)的裂解緩沖液穩(wěn)定病毒RNA的能力不盡相同,實(shí)際應(yīng)用之前需進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3)Lysis Solution、Buffer AVL和ERA三種裂解溶液均可完全滅活流感病毒,經(jīng)裂解緩沖液初步裂解后的核酸提取操作的生物危害風(fēng)險(xiǎn)大大降低。這對(duì)于將流感病毒