成骨細(xì)胞玻璃化冷凍保護劑的研究.pdf

1、該文的研究目的是篩選適合成骨細(xì)胞的玻璃化溶液組成,為成骨細(xì)胞及骨組織玻璃化保存提供有價值的參考知識.首先選用三種滲透性冷凍保護劑:二甲基亞砜(DMSO 45%w/w)、2,3-丁二醇(BD 32%w/w)和1,2-丙二醇(PD 45%w/w),分別用低溫顯微鏡系統(tǒng)和差示量熱掃描儀(DSC)觀察其玻璃化能力和現(xiàn)象,并確定其低溫斷裂溫度、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和濃度.為降低滲透性玻璃化溶液的濃度,用糖類非滲透性冷凍保護劑一海藻糖、蔗糖、葡萄糖代替一

2、部分滲透性冷凍保護劑,并用低溫顯微系統(tǒng)觀察其玻璃化能力,從而確定實驗用的玻璃化溶液的濃度.研究結(jié)果表明:除BD(40%w/w)玻璃化濃度高于文獻(xiàn)報道外,DMSO和PD均與文獻(xiàn)相符.采用糖類能夠降低滲透性保護劑的濃度,溶液也可以實現(xiàn)玻璃化.另外,快速冷凍易于抑制溶液中冰晶的生長,可以達(dá)到較好的玻璃化效果.該實驗采用的玻璃化溶液在冷凍過程中都不同程度地出現(xiàn)了低溫斷裂現(xiàn)象.斷裂溫度低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,為避免玻璃體斷裂對細(xì)胞和組織產(chǎn)生的損傷,推

3、薦以不產(chǎn)生低溫斷裂的冷凍速率降溫到介于其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和低溫斷裂溫度之間的某一溫度,并在此狀態(tài)保存.選定了玻璃化溶液后,先確定玻璃化溶液對成骨細(xì)胞活性影響的實驗方法:0~4℃,在成骨細(xì)胞中導(dǎo)入玻璃化溶液,平衡5min,室溫下(~20℃)用培養(yǎng)基分兩次洗脫后,接種到孔板中培養(yǎng),培養(yǎng)24hr后,用MTT比色法檢測細(xì)胞活性.用此實驗方法,比較滲透性玻璃化溶液,PD中加入糖類的玻璃化溶液和DMSO中加入糖類的玻璃化溶液對成骨細(xì)胞活性的影響.結(jié)果

4、表明:三種滲透性冷凍保護劑單獨使用時,細(xì)胞成活率都很低,在10%左右,說明三種滲透性冷凍保護劑單獨使用對細(xì)胞的毒性都很大.在PD中加入糖類,對細(xì)胞成活率沒有顯著提高,而在DMSO中加入糖類,顯著提高了細(xì)胞成活率.其中,以39%DMSO+6%海藻糖的效果最好,成活率達(dá)到46.4%.利用K-K模型模擬計算了單濃度一次性導(dǎo)入和多濃度分步導(dǎo)入冷凍保護劑對成骨細(xì)胞體積的變化.結(jié)果表明:單濃度一次性導(dǎo)入時,隨著冷凍保護劑濃度的增大,冷凍保護劑的滲透