牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞玻璃化冷凍保護(hù)劑及組織低溫?cái)嗔严椒ǖ难芯?pdf

1、深低溫保存是實(shí)現(xiàn)角膜長(zhǎng)期保存的最有效方法。角膜的慢速凍存法和冷凍干燥法本身存在著很多問(wèn)題，這使得玻璃化法保存角膜成為一種重要的途徑。 在玻璃化法保存中，冷凍保護(hù)劑能夠促進(jìn)冷凍體系向玻璃態(tài)的轉(zhuǎn)變，減少對(duì)細(xì)胞或組織的低溫?fù)p傷。由保護(hù)劑和載體溶液構(gòu)成的玻璃化溶液是組織玻璃化法保存的研究熱點(diǎn)之一。然而，對(duì)于不同的細(xì)胞或組織，同一種保護(hù)劑會(huì)顯示出不同程度的毒性及滲透能力，使得最終的保護(hù)效果也有所不同。到目前為止，保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞或組織的作用機(jī)

2、理還不清楚。在為一種既定的細(xì)胞類(lèi)型選擇保護(hù)劑時(shí)，很大程度上依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)的方法。 內(nèi)皮細(xì)胞是角膜組織中最重要的細(xì)胞類(lèi)型。本論文首先以牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞為保存對(duì)象，篩選合適的保護(hù)劑和玻璃化溶液。首先，系統(tǒng)地研究了滲透性保護(hù)劑，在考察其玻璃化能力和毒性的基礎(chǔ)上，以冷凍保存的效果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，獲得了一種較好的滲透性保護(hù)劑組分。然后，分別研究了糖類(lèi)非滲透性保護(hù)劑和大分子非滲透性保護(hù)劑。同樣以冷凍保存的效果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，在確定保存效果較好的糖和大分子

3、的種類(lèi)后，確定各自的最優(yōu)濃度。本論文中，滲透性保護(hù)劑的篩選范圍包括二甲基亞砜、乙二醇(EG)、1，2-丙二醇、2，3-丁二醇、乙酰胺和乙二醇單甲醚：糖類(lèi)非滲透性保護(hù)劑包括木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和海藻糖；大分子則包括聚蔗糖(MW7，000)、葡聚糖(MW7，OOO)、硫酸軟骨素(CS，MW18，000～30，000)、牛血清白蛋白(MW68，000)和聚乙二醇(MW6，000、10，000和20，000)。細(xì)胞活性評(píng)估的

4、主要方法為臺(tái)盼蘭拒染法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙二醇、葡萄糖和硫酸軟骨素的保護(hù)效果最好。由此獲得的玻璃化溶液的組成是：載體溶液-乙二醇-葡萄糖-硫酸軟骨素，其中，乙二醇、葡萄糖和硫酸軟骨素的質(zhì)量百分比濃度分別為52％、8％和3％。冷凍保存后角膜內(nèi)皮細(xì)胞的活率高達(dá)89.4+2.1％，并且繼續(xù)培養(yǎng)后細(xì)胞的活力能夠得到恢復(fù)。 在組織的玻璃化法保存中，通常采用一步降溫的方式，即將凍存對(duì)象直接投入液氮。這種降溫方式的降溫速率較快，

5、會(huì)在組織內(nèi)引起較大的熱應(yīng)力。當(dāng)熱應(yīng)力超越組織的承受極限，組織就會(huì)發(fā)生低溫?cái)嗔?。斷裂?huì)影響組織的保存效果，而且有斷裂存在的組織是絕不允許用于臨床的。 本論文提出了兩步降溫即首先在冷氮?dú)庵薪禍厝缓笤俎D(zhuǎn)移至液氮的冷凍方法。兩步降溫方法的降溫速率較一步法降溫要低，有利于削弱凍存組織內(nèi)的熱應(yīng)力進(jìn)而消除組織的斷裂。本章首先研究了兩步降溫及復(fù)溫過(guò)程中玻璃化溶液的斷裂情況，并且確定了兩步降溫法的操作參數(shù)；然后分別以肉眼、光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微

6、鏡考察了復(fù)蘇后組織的斷裂情況。結(jié)果表明，在兩步降溫的過(guò)程中，僅在純玻璃化溶液的表面區(qū)域有宏觀斷裂，在溶液的主體部分沒(méi)有斷裂發(fā)生。也就是說(shuō)，兩步降溫法能夠消除玻璃化溶液主體部分的宏觀斷裂。在執(zhí)行兩步降溫時(shí)，首先在降溫的第一步，應(yīng)將凍存對(duì)象置于氮?dú)庵?196～-135℃的溫度區(qū)間內(nèi)，在-80℃以上溫度的降溫速率應(yīng)大于10℃/min；當(dāng)其溫度降到-100℃以下，即可將凍存對(duì)象浸入液氮，降溫速率應(yīng)小于165℃/min。在經(jīng)歷兩步降溫冷凍后的牛角

7、膜、牛血管和豬的軟骨組織上找不到任何宏觀和微觀的裂紋。本方法不需要大型設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，適合于大規(guī)模推廣使用。 組織的玻璃化法保存中，玻璃化溶液的導(dǎo)入和導(dǎo)出方案極大地影響著保存的效果。合適的方案有利于減弱對(duì)細(xì)胞的毒性損傷和滲透損傷。對(duì)于分步法導(dǎo)入和導(dǎo)出保護(hù)劑，保護(hù)劑與細(xì)胞的平衡時(shí)間是導(dǎo)入和導(dǎo)出方案中的重要因素。本論文以正交實(shí)驗(yàn)的方法確定分步導(dǎo)入和導(dǎo)出保護(hù)劑過(guò)程的平衡時(shí)間。結(jié)果表明：導(dǎo)入過(guò)程中，與10％EG、25％EG、50％EG和

8、52％EG-8％Glucose-3％CS的最佳平衡時(shí)間分別為4min、5min、6min和3min；導(dǎo)出過(guò)程中，與50％EG-5％glucose.25％EG-5％glucose、10％EG-5％glucose和5％glucose的最佳平衡時(shí)間分別為4min、6min、6min和6min。 最后，論文應(yīng)用篩選獲得的玻璃化溶液和最佳的平衡時(shí)間以及兩步降溫方法保存牛角膜，發(fā)現(xiàn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的活率為41.0±5.9％，顯著高于目前文獻(xiàn)報(bào)道