中藥痹愈湯治療類風濕關節(jié)炎骨破壞和骨修復的研究.pdf

1、1.實驗背景 類風濕關節(jié)炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一個慢性進展性骨破壞的過程，骨破壞是RA診斷標準的一項內(nèi)容，延緩甚至阻斷RA病人的骨質(zhì)破壞成為RA治療的重要目標之一。 RA的病理特征是滑膜慢性炎癥，軟骨吸收、骨質(zhì)破壞和骨纖維化，基本病理改變是滑膜炎。 破骨細胞是骨侵蝕的主要因素，雖然有多種激素、細胞因子參與了前體破骨細胞向活化的破骨細胞分化過程的調(diào)節(jié)，但目前認為RANKL是前體破骨細胞

2、分化、成熟的啟動因子，RANKL與受體RANK的相互作用是破骨細胞生成的基本信號。RANKL可以促進破骨細胞分化、刺激破骨細胞活化和提高破骨細胞存活，抑制破骨細胞凋亡。在正常條件下，成纖維樣滑膜細胞RANKL表達量低，而在RA疾病條件下，RANKL表達量增高。RANKL在關節(jié)滑膜、骨組織及外周血中表達增多是RA關節(jié)及全身骨質(zhì)丟失的主要原因之一。 作為一種拮抗劑性細胞因子，OPG可以競爭性的方式、高親和力與RANKL特異性結合，阻

3、止RANKL與RANK的結合，負向調(diào)節(jié)(抑制)破骨細胞的分化和活化，并提高破骨細胞凋亡，從而抑制骨吸收，在骨代謝調(diào)節(jié)中起著關鍵性作用。OPG和RANKL表達水平，可作為決定破骨細胞介導的骨吸收程度的指標。 RA關節(jié)軟骨和骨組織的損害主要是由于滑膜細胞的活化和增生而引起的，RA患者滑膜細胞存在細胞凋亡過程的異常，與凋亡的不足有關。 類風濕關節(jié)炎屬中醫(yī)學“痹病”的范疇，痹病泛指機體正氣不足，衛(wèi)外不固，邪氣乘虛而入，致使氣血凝

4、滯，經(jīng)絡痹阻，引起相關系統(tǒng)疾病的總稱。骨質(zhì)破壞屬于“骨痹”范疇。 胡蔭奇主任醫(yī)師在臨床上以中藥痹愈湯(骨碎補10g、青風藤15g、伸筋草10g、土貝母15g、莪術10g)為基礎方，治療痹病屬于肝腎虧虛的證侯，取得良好效果。 2實驗目的 本研究在臨床的基礎上，通過建立SD大鼠膠原性關節(jié)炎模型，給予正常、大劑量中藥痹愈湯和甲氨蝶呤進行治療。通過治療前后關節(jié)骨破壞、骨修復病理變化，以及原位雜交RANKL、OPGmRNA

5、和TUNKL前后的比較，探討中藥痹愈湯、甲氨蝶呤對骨破壞、修復的作用機制和療效。 3實驗方法 3.1實驗研究 3.1.1分組：雌性健康SD大鼠50只，體重146±20g，鼠齡4-5周。依照隨機表法分成5組：空白組、模型組、大劑量中藥治療組、正常劑量中藥治療組、甲氨蝶呤治療組，每組10只。 3.1.2造模過程及實驗方法： Ⅱ型膠原蛋白誘導的SD大鼠關節(jié)炎模型的建立，將酸溶性型膠原蛋白(collage

6、n，CⅡ)用弗氏完全佐劑配成CⅡ濃度為2.5mg/ml的乳劑，按每只大鼠100μL乳劑含CⅡ250μg，于左后足跖皮內(nèi)注射致炎，正常對照組大鼠注射0.9﹪生理鹽水100μ1/只。Ⅱ型膠原誘導的關節(jié)炎模型成膜率為50﹪-80﹪，本實驗一般情況結合病理，其中大劑量中藥治療組、正常劑量中藥治療組和模型組成模8只，甲氨蝶呤治療組成模7只大鼠。 ①模型組：造模后10天開始每日給予2ml生理鹽水/只灌胃。 ②正常劑量中藥治療組：造模

7、后10天，每日每只大鼠給予中藥生藥0.6g/100g(水煎溶液2ml)只灌胃。 ③大劑中藥治療量組：造模后10天，每日每只大鼠給予中藥生藥1.2g/100g(水煎溶液2ml)只灌胃。 ④甲氨蝶呤治療組：造模后10天，每周每只大鼠按0.1mg/100g的劑量灌胃，每周一次。未用藥的實驗日給予0.9﹪生理鹽水2ml灌胃，每天一次。 ⑤正常組：不做任何處理。 以上各組大鼠治療30天后，同時每只由腹主動脈抽取4～

8、6ml血液，制備血清備用；取雙側踝關節(jié)，放置在含多聚甲醛和DEPC的固定液固定備用。 3.2觀察指標 3.2.1一般情況檢測：大鼠體重、足跖趾厚度； 3.2.2病理檢測：大鼠踝關節(jié)HE染色切片檢測； 3.2.3原位雜交檢測：OPG、RANKLmRNA探針 3.2.4TUNKL 4踝關節(jié)病理改變觀察 正常組：關節(jié)結構正常，滑膜組織無充血水腫，滑膜細胞無增生現(xiàn)象，無血管翳形成，骨及軟骨

9、結構正常。關節(jié)軟骨表面光滑平整，無剝脫現(xiàn)象，關節(jié)軟骨下骨小梁面積大小、排列正常。 模型組：明顯的滑膜細胞增生，排列紊亂，可見數(shù)層排列不規(guī)則的滑膜細胞，滑膜組織充血水腫，毛細血管增生，并可見炎細胞浸潤；增生的滑膜組織形成絨毛狀，滑膜細胞層增生到5～10層，伸向關節(jié)腔深處，或向軟骨爬行形成血管翳。在血管翳覆蓋下的軟骨表層可見明顯的軟骨表層組織的變性、壞死，關節(jié)軟骨面剝脫。軟骨下骨的骨小梁面積大小無改變、排列正常。 治療組：滑

10、膜細胞增生減輕，滑膜組織充血水腫明顯減輕，血管增生和浸潤炎性細胞數(shù)量減少，滑膜細胞層3-5層。血管翳形成顯著減少。關節(jié)軟骨面可見扁平層剝脫，剝脫軟骨面較平整，軟骨下骨的骨小梁面積大小、排列正常。 5結果： 5.1造模前、7天、14天、21天、28天、35天各組體重檢測結果 中、西藥治療組、模型組大鼠體重從第14天起和正常組之間有顯著性差異(P＜0.05)，正常組體重最重。從試驗第21天起模型組和中、西藥治療組體重

11、有顯著性差異(P＜0.05)，其中模型組體重體重最輕，且隨時間的延長，影響程度逐漸加重。 大劑量中藥治療組、正常劑量中藥治療組、甲氨蝶呤治療組大鼠各時段體重無明顯差異，P＞0.05。 5.2造模前、7天、14天、21天、28天、35天各組雙側后肢跖趾厚度檢測結果 大劑量中藥治療組、正常劑量中藥治療組、甲氨蝶呤治療組大鼠跖趾厚度呈山峰狀先增加，第7天開始正常組和大劑量中藥治療組、正常劑量中藥治療組、甲氨蝶呤治療組、

12、模型組大鼠跖趾厚度具有顯著性差異，P＜0.01。到21天最高，然后逐降低。各治療組從第28天跖趾厚度和正常組無明顯差異，P＞0.05。模型組大鼠跖趾厚度增加后無明顯下降。 5.3OPG平均光密度和陽性細胞計數(shù) 5.3.1治療30天OPG平均光密度檢測結果 給藥30天后，大劑量中藥治療組、正常劑量中藥治療組、甲氨蝶呤治療組均比模型組顯著上調(diào)大鼠OPG的陽性細胞的平均光密度，P＜0.05。正常組和治療各組大鼠OPG陽

13、性細胞、各治療組之間平均光密度之間無顯著性差異，P＞0.05。 大劑量中藥治療組對大鼠OPG陽性細胞的平均光密度的影響明顯高于正常劑量中藥治療組、甲氨蝶呤治療組，P＜0.05。 5.3.2治療30天OPG陽性細胞計數(shù)檢測結果 正常劑量中藥治療組、大劑量中藥治療組、甲氨蝶呤治療組和模型組、正常組OPG的陽性細胞數(shù)有顯著性差異P＜0.01。各治療組大鼠OPG陽性細胞的計數(shù)之間均有顯著性差異，P＜0.01。其中中藥大劑

14、量治療組陽性細胞數(shù)上調(diào)最多，正常劑量中藥治療組次之，甲氨蝶呤治療組再次，模型組再次之，正常組陽性細胞數(shù)最少。模型組和正常組OPG的陽性細胞數(shù)之間無顯著性差異。 5.3.3總之：正常劑量中藥治療組、大劑量中藥治療組和甲氨蝶呤治療組比模型組和正常組明顯上調(diào)OPG的平均光密度和計數(shù)。其中大劑量中藥治療組優(yōu)于、甲氨蝶呤治療組和正常劑量中藥治療組。 5.4治療30天RANKL平均光密度和陽性細胞計數(shù) 5.4.1治了30天R

15、ANKL平均光密度 造模后，給予藥物治療30天，正常劑量中藥治療組、大劑量中藥治療組、甲氨蝶呤治療組、模型組均能顯著上調(diào)大鼠RANKL的平均光密度，和正常組大鼠之間有顯著性差異，P＜0.05。各治療組和模型組之間無顯著性差異，P＞0.05。 5.4.2治療30天RANKL陽性細胞計數(shù) 造模后給予藥物治療30天，正常劑量中藥治療組、大劑量中藥治療組、甲氨蝶呤治療組、模型組均能顯著上調(diào)RANKL的陽性細胞數(shù)，明顯高于

16、正常組RANKL的陽性細胞數(shù)，P＜0.01。各治療組和模型組RANKL的陽性細胞數(shù)之間無顯著性差異，P＞0.05。 5.4.3總之：正常劑量中藥治療組、大劑量中藥治療組、甲氨蝶呤治療組和模型組沒有明顯區(qū)別，均比正常組上調(diào)RANKL的平均光密度和計數(shù)。 5.5治療30天滑膜細胞凋亡率檢測結果 正常組、治療各組大鼠滑膜細胞凋亡率和模型組有顯著性差異，P＜0.05。正常組、大劑量中藥治療組和甲氨蝶呤治療組滑膜細胞凋亡率