SIRT3介導的呼吸鏈復合體質量控制機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　乙?；揎棡榧毎麅鹊鞍踪|翻譯后修飾的一種，可逆的乙酰化修飾過程可通過改變基因表達水平，蛋白酶活性以及蛋白蛋白相互作用調節(jié)細胞的各類活動。在線粒體內總計1000-1500個蛋白中，大約有200多個蛋白存在乙?；揎椬饔茫渲卸鄶?shù)蛋白的乙?；揎椨蒒AD+依賴的去乙酰化酶SIRT3完成。SIRT3主要位于線粒體基質，線粒體內有100多個蛋白的去乙?；cSIRT3相關。SIRT3表達的變化與線粒體內ATP的生成，ROS水

2、平，蛋白的氧化損傷，以及呼吸鏈復合體Ⅰ與Ⅱ的活性密切相關。SIRT3的異常低表達或缺失能夠導致包括癌癥，衰老以及衰老相關的退行性疾病的發(fā)生。研究已經(jīng)明確，SIRT3缺失或低表達能夠顯著提升細胞內氧化應激水平和蛋白質氧化損傷。而細胞內氧化應激水平的提高和蛋白質氧化損傷的加劇同樣也是線粒體蛋白質量控制低下的主要指標，并且與SIRT3異常相關的各類疾病同樣也發(fā)生于線粒體蛋白質量控制缺陷的細胞中。雖然SIRT3相關的線粒體蛋白質量控制的研究在過

3、去的2-3年內已逐漸開展，而針對呼吸鏈復合體水平的蛋白質量控制研究未見有任何報道。由于線粒體內行使氧化磷酸化的蛋白均為復合體形式存在，直接對復合體水平而不是亞基水平的蛋白質量控制機制進行研究將更有利于疾病發(fā)生機制的闡述。
　　研究目的:
　　1.明確SIRT3對線粒體功能的調控作用，其中包括線粒體ATP的生成，ROS生成，呼吸鏈復合體的酶活性;
　　2.通過體內和體外實驗分析SIRT3與線粒體蛋白質量控制的關系;

4、>　　3.明確SIRT3通過何種途徑干預線粒體蛋白的質量控制，為SIRT3相關疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的科學依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.利用分子生物學手段建立SIRT3高表達細胞模型以及Sirt3基因敲除動物模型來研究SIRT3對線粒體生物學功能的改變作用;
　　2.利用非變性凝膠/免疫印跡技術以及呼吸鏈酶活性分析技術分析SIRT3與線粒體呼吸鏈復合體蛋白質量的關系;
　　3.通過同位素示蹤以及免疫印跡技術研究S

5、IRT3對線粒體復合體質量的影響;
　　4.利用免疫共沉淀技術尋找能夠調控線粒體復合體質量且被SIRT3乙?；揎椀姆肿影閭H蛋白或蛋白酶;
　　5.利用免疫共沉淀/質譜分析技術以及同位素免疫共沉淀技術研究分子伴侶調控線粒體復合體質量控制的機制;
　　6.利用RNA干擾技術進一步確認SIRT3是否通過對特定靶蛋白的去乙?；揎椪{控呼吸鏈復合體的質量。
　　研究結果:
　　1.不管是長鏈SIRT3還是短鏈SIR

6、T3均能影響線粒體功能，結合以前的研究，我們發(fā)現(xiàn)SIRT3能夠通過其乙?；饔糜绊懞粑湉秃象wⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ的功能，復合體功能的改變也直接導致了線粒體ATP生成水平的改變。
　　2.SIRT3高表達能降低線粒體呼吸鏈復合體的含量，相應的Sirt3基因敲除能夠提升復合體的含量，我們推測SIRT3可能通過影響復合體的組裝達到對呼吸鏈復合體含量的負調控作用，這種負調控作用在一定程度上增加了單位量復合體的酶活性。表明SIRT3與線粒體

7、呼吸鏈復合體的質量控制存在相關性。
　　3.SIRT3通過加快呼吸鏈復合體的更新速度（組裝與去組裝）來完成其對呼吸鏈復復合體的負調控作用。
　　4.作為蛋白質量控制重要組成的GRP75功能受SIRT3調控，而SIRT3對呼吸鏈復合體質量控制的調控作用可能經(jīng)由GRP75得以完成。
　　5.SIRT3介導的呼吸鏈復合體快速更新取決于較高水平的GRP75與呼吸鏈復合體的相互作用。GRP75的低表達能夠通過下調呼吸鏈復合體蛋白

8、的降解與組裝速度降低SIRT3過表達細胞中呼吸鏈復合體的更新速率。
　　6.GRP75是SIRT3介導的呼吸鏈復合體質量控制的主要調控因子，高質量的呼吸鏈復合體將進一步降低線粒體內ROS的生成，從而維持更高質量的呼吸鏈復合體蛋白。
　　結論:
　　SIRT3對GRP75蛋白的去乙酰化修飾作用能夠增加線粒體呼吸鏈復合體蛋白的更新，而這種快速更新可以通過對錯誤組裝以及損傷的呼吸鏈復合體高效清除能力來提高呼吸鏈復合體的質量。