日本大耳兔耐受常溫膽道缺血最大安全時(shí)限的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、缺血再灌注是肝移植和肝膽外科中常見的病理生理現(xiàn)象，它對(duì)肝臟和膽道系統(tǒng)均造成不同程度的損傷。尤其是結(jié)構(gòu)特殊的膽道，往往是熱缺血、冷缺血及再灌注等所致?lián)p傷的重要靶組織。膽道I/R主要表現(xiàn)在對(duì)膽管壁和膽管細(xì)胞的損傷，會(huì)造成膽道狹窄，膽道周圍炎癥及膽管細(xì)胞破壞等。膽道并發(fā)癥包括膽漏、膽道狹窄及梗阻、膽道感染以及膽泥與膽結(jié)石等，損傷嚴(yán)重時(shí)可致移植肝功能喪失。由此可見，膽道I/R損傷與肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。 肝內(nèi)外膽道的供血來

2、源、組織結(jié)構(gòu)、生理功能不盡相同，各部位膽道I/R損傷各有何特點(diǎn)?肝臟耐受膽道缺血的安全時(shí)限?等都是值得探討的課題。因此，建立更為理想的膽道I/R動(dòng)物模型來研究這些特點(diǎn)，對(duì)預(yù)防和降低肝膽手術(shù)并發(fā)癥，提高手術(shù)質(zhì)量及患者生存質(zhì)量有重要的臨床意義。 過去研究膽道I/R損傷模型多采用第一肝門、膽總管或肝動(dòng)脈的阻斷、結(jié)扎或切斷后重建等動(dòng)物模型，均有其不足之處：1結(jié)扎膽道血供后無法復(fù)制再灌注損傷的病理生理過程；2僅阻斷肝外膽道或肝內(nèi)外大部分膽

3、道血供；3未避免門靜脈阻斷引起的肝臟熱缺血對(duì)肝內(nèi)外膽道損傷的影響；4動(dòng)物過小無法采集足夠量的組織標(biāo)本；5操作繁雜，復(fù)模困難等。此外，既往模型均未放置膽道引流管，無法監(jiān)測(cè)術(shù)后膽汁變化。 鑒于此，我們采用日本大耳兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察膽道I/R后的肝膽功能、膽汁成份和組織學(xué)改變，建立膽道I/R損傷模型，并在該模型的基礎(chǔ)上分析兔肝臟耐受膽道I/R的安全時(shí)限，為臨床上阻斷膽道血流的時(shí)間及設(shè)計(jì)合理手術(shù)方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4、 實(shí)驗(yàn)方法與主要結(jié)果 1.日本大耳免膽道缺血再灌注損傷模型的建立 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用無損傷動(dòng)脈夾聯(lián)合阻斷膽總管及肝總動(dòng)脈制作膽道缺血模型，到達(dá)預(yù)定時(shí)限后去除動(dòng)脈夾恢復(fù)膽道血流。以單純肝總動(dòng)脈阻斷為對(duì)照組。選擇日本大耳白兔80只，按隨機(jī)表法分成五組：假手術(shù)組(SO組)、單純肝動(dòng)脈阻斷2h、3h組(HAO2h、HAO3h組)、肝動(dòng)脈和膽總管聯(lián)合阻斷2h、3h組(HBO2h、3h組)，每組16只，其中8只用于觀察術(shù)后7d生存率。

5、利用兔肝內(nèi)外膽道血供特點(diǎn)，以無損傷動(dòng)脈夾平十二指腸上緣夾閉肝總動(dòng)脈或聯(lián)合夾閉肝總動(dòng)脈、遠(yuǎn)端膽總管和其問的疏松結(jié)締組織，到達(dá)阻斷時(shí)限后去除動(dòng)脈夾即恢復(fù)肝動(dòng)脈或膽道血流。SO組只游離肝周韌帶、膽總管、肝總動(dòng)脈及門靜脈。分別于缺血前、缺血末、復(fù)流12h、24h、48h、72h及7d取血液、膽汁標(biāo)本，測(cè)定各時(shí)相點(diǎn)血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽汁酸(TBA)和膽汁TBA、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)、總膽紅素(TBI

6、L)水平；觀察阻斷前后肝臟的色質(zhì)、膽汁外觀及肝臟組織病理學(xué)改變，并統(tǒng)計(jì)復(fù)流后7d動(dòng)物存活情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.阻斷前后肝臟大體變化：SO組及各阻斷組阻斷前肝臟顏色紅潤(rùn)；HAO2h、HAO3h組缺血末肝葉變暗，肝臟輕度腫脹。HBO2h組肝葉呈紅褐色，以肝門部、肝邊為著，肝臟輕～中度腫脹；HBO3h組肝葉為花斑樣，黃褐相問，以肝門部、肝右葉、尾葉為主，肝臟中～高度腫脹。2.阻斷前后肝功能變化：隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，HAO2h、HAO3

7、h組膽道復(fù)流后早期血清ALT、AST、TBA輕微增高，術(shù)后7d基本恢復(fù)；而HBO2h、HBO3h組急劇上升，再灌注后12h達(dá)峰值，后逐漸回落，術(shù)后7d仍顯著高于SO組。在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)，HBO組各參數(shù)均顯著高于HAO組，HBO3h組亦顯著高于HBO2h組(P＜0.05)。3.阻斷前后膽汁外觀及成份變化：SO組膽汁呈翠綠色，透明無雜質(zhì)。HAO2h、HAO3h組膽汁顏色微暗，稍混；HBO2h、HBO3h組膽汁稀薄，呈暗綠色、褐棕色，部分有絮狀物

8、、膽泥。隨著膽道缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，HAO2h、HAO3h組γ-GGT、TBIL及TBA輕度增高，后迅速下降；而HBO2h、HBO3h組上述指標(biāo)明顯上升，缺血末TBIL達(dá)高峰，TBA與γ-GGT分別于復(fù)流12h、1d達(dá)峰值，后逐漸下降(P＜0.05)。HBO2h、3h組術(shù)后7d膽汁γ-GGT、TBIL均顯著高于SO組(P＜0.05)。4.術(shù)后7d存活率：SO、HAO2h、HAO3h、HBO2h組術(shù)后7d存活率均為100％(8/8)。HBO3

9、h組為75％(6/8)，與SO組相比差異顯著(P＜0.05)。5.動(dòng)物肝臟病理變化(1)術(shù)后7d大體形態(tài)：SO、HAO2h組肝臟基本正常；HAO3h組肝臟以缺血腫脹為主，偶見點(diǎn)狀壞死；HBO2h組以缺血腫脹、點(diǎn)狀/小片狀壞死為特征；HBO3h組肝臟多見片狀壞死、肝葉壞死。(2)肝膽組織石蠟切片HE染色光鏡：SO組基本正常；HAO2h、HAO3h、HBO2h組以膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等可逆性損傷為主，肝組織散在點(diǎn)狀、小片狀壞死灶

10、；HBO3h組以膽管上皮脫落、灶性/肝葉壞死灶等不可逆損傷為主。結(jié)果提示隨著阻斷時(shí)間的延長(zhǎng)，膽道I/R損傷逐漸加重，由可逆性損傷轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡嫘該p傷。 2.日本大耳兔耐受常溫膽道血流阻斷最大安全時(shí)限的確立 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：借助上述HBO組動(dòng)物模型，通過動(dòng)物7d存活率、肝功能、肝臟能量代謝及組織病理改變的可逆性來分析兔肝臟耐受膽道I/R的最大安全時(shí)限。采用健康成年日本大耳兔190只隨機(jī)分為：SO組、肝動(dòng)脈和膽總管聯(lián)合阻斷2h、2.

11、5h、3h、3.5h組(HBO2h組、HBO2.5h組、HBO3h組和HBO3.5h組)，每組36只；其中8只用于觀察術(shù)后7d生存率。分別于缺血前、缺血末、復(fù)流12h、24h、48h、72h及7d活殺動(dòng)物，留取下腔靜脈血以及右肝前葉組織，以7d存活率、肝功能、肝組織三磷酸腺苷(ATP)含量、線粒體呼吸控制比(RCR)、病理形態(tài)學(xué)為觀察指標(biāo)，以動(dòng)物存活率為100％的膽道血流阻斷時(shí)間初步設(shè)定為最大安全時(shí)限。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1動(dòng)物7d存活

12、率：日本大耳兔持續(xù)膽道缺血2h、2.5h復(fù)流后7d，動(dòng)物全部存活；阻斷膽道血流時(shí)間延長(zhǎng)后，各組死亡數(shù)增高，阻斷3h、3.5h后存活率分別為75％、50％，顯著高于SO組(P＜0.05)。2肝功能各參數(shù)于缺血后不同程度升高。HBO2h、HBO2.5h組于復(fù)流后上升緩慢，HBO3h、HBO3.5h組于復(fù)流后明顯升高，于12h達(dá)峰值，后逐漸回落，術(shù)后7d與SO組相比差異顯著(P＜0.05)。3肝臟組織ATP含量：缺血后各缺血組肝組織ATP水平

13、均不同程度降低。復(fù)流12h之后HBO2h、HBO2.5h組ATP水平均不同程度恢復(fù)，2d后基本恢復(fù)。HBO3h、HBO3.5h組于復(fù)流12h降至谷值，后逐漸恢復(fù)，7d后仍顯著低于SO組(P＜0.05)。在復(fù)流12h及1w，HBO3h、HBO3.5h組顯著高于HBO2h、HBO2.5h組(P＜0.05)。4肝臟線粒體呼吸功能：各參數(shù)于缺血后不同程度降低。HBO2h、HBO2.5h組至復(fù)流24h時(shí)已分別恢復(fù)到缺血前的65％、57％。而HBO

14、3h、HBO3.5h組一直處于較低水平，在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)，均顯著低于HBO2h、HBO2.5h組(P＜0.05)。5肝臟病理改變隨缺血及再灌注時(shí)間延長(zhǎng)損傷逐漸加重。光鏡變化：膽道缺血2h、2.5h者，以膽管上皮、肝細(xì)胞水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等可逆性損傷為主。缺血3h、3.5h者則見膽管粘膜上皮壞死脫落，肝細(xì)胞灶性壞死等不可逆性損傷為主。電鏡變化：缺血不超過2.5h者以膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞水腫，線粒體腫脹、空泡變等可逆性損傷為主；而缺血3h及3.5

15、h者阻斷末膽道以膽管上皮脫落、線粒體內(nèi)電子致密物及壞死灶形成等不可逆性損傷為特征。 結(jié)論 1.采用動(dòng)脈夾聯(lián)合膽總管及肝總動(dòng)脈阻斷的膽道缺血模型膽道缺血完全，復(fù)制簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，是研究膽道I/R損傷的理想模型，并可通過設(shè)定阻斷時(shí)間的長(zhǎng)短模擬臨床不同程度的I/R損傷。 2.隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞損傷程度逐漸加重。HBO2.5h以內(nèi)的膽道I/R以膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞水腫，線粒體腫脹、空泡變及炎細(xì)胞浸潤(rùn)