Tβ4基因在缺氧、炎癥環(huán)境下對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的:間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)主要來源于骨髓,也被少量發(fā)現(xiàn)于其他組織如脂肪、骨膜、牙周韌帶、胎盤等,具有多分化潛能、免疫調(diào)節(jié)特性、旁分泌作用等,目前是國內(nèi)外細(xì)胞移植治療心肌梗死的熱點(diǎn)。然而,由于心肌組織壞死后誘發(fā)炎癥反應(yīng),加上缺乏氧氣,故心肌梗死處微環(huán)境惡劣,移植細(xì)胞凋亡率高。胸腺素β4(Thymosinbeta4,Tβ4),作為一種內(nèi)源性43個(gè)氨基酸肽,研究發(fā)現(xiàn)其有調(diào)節(jié)免疫及炎性反應(yīng)、抗凋亡、

2、促血管再生等作用。本實(shí)驗(yàn)將Tβ4基因轉(zhuǎn)入BMSCs,觀察是否能夠提高BMSCs在缺氧、炎癥環(huán)境抗凋亡能力,并研究其可能的機(jī)制,以期待提高移植BMSCs在心梗部位的生存率。
　　方法:獲取和培養(yǎng)原代BMSCs;構(gòu)建過表達(dá)Tβ4基因的慢病毒載體,將其病毒包裝后轉(zhuǎn)染BMSCs,轉(zhuǎn)染完畢后利用Westernblot(WB)檢測(cè)Tβ4基因在BMSCs中的表達(dá)情況;構(gòu)建缺氧環(huán)境,然后將細(xì)胞分為三組:Tβ4轉(zhuǎn)染組、對(duì)照病毒組、未轉(zhuǎn)染組,置于缺氧

3、環(huán)境中流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況,WB檢測(cè)各組細(xì)胞BAX和BCL-2表達(dá)情況;構(gòu)建炎癥環(huán)境,分組同前,流式細(xì)胞儀各組細(xì)胞凋亡情況,WB檢測(cè)各組細(xì)胞MMP-9和IL-10表達(dá)情況。
　　結(jié)果:Tβ4基因質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖譜示酶切片段為143bp,與預(yù)期相符;菌落PolymeraseChainReaction(PCR)鑒定示陰性轉(zhuǎn)化子得到198bp片段,陽性轉(zhuǎn)化子得到333bp片段,表明Tβ4基因已經(jīng)成功插入慢病毒載體中;

4、測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符合;WB示Tβ4轉(zhuǎn)染組在33KDA處有特征條帶,其大小和Tβ4融合蛋白(5KDA+28KDA)相吻合,而對(duì)照病毒組和未轉(zhuǎn)染組中未檢測(cè)到目的蛋白表達(dá),故Tβ4融合GFP共同表達(dá);缺氧處理后流式細(xì)胞儀結(jié)果示Tβ4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照病毒組、未轉(zhuǎn)染組低(P<0.05),WB結(jié)果顯示BCL-2表達(dá)量Tβ4轉(zhuǎn)染組高于對(duì)照病毒組和未轉(zhuǎn)染組(P<0.05);BAX表達(dá)量Tβ4轉(zhuǎn)染組低于對(duì)照病毒組和未轉(zhuǎn)染組(P<0.05);炎癥處理

5、后流式細(xì)胞儀結(jié)果示Tβ4轉(zhuǎn)染組凋亡率較對(duì)照病毒組、未轉(zhuǎn)染組低(P<0.05),WB示MMP-9表達(dá)量Tβ4轉(zhuǎn)染組低于對(duì)照病毒組和未轉(zhuǎn)染組(P<0.05);IL-10表達(dá)量Tβ4轉(zhuǎn)染組高于對(duì)照病毒組和未轉(zhuǎn)染組(P<0.05);
　　結(jié)論:成功構(gòu)建含有Tβ4基因的慢病毒載體,并在BMSCs中成功表達(dá);上調(diào)Tβ4基因在BMSCs中的表達(dá)能夠增加其在缺氧中抗凋亡能力,其可能的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)BCL-2和BAX的表達(dá);上調(diào)Tβ4基因在BMSC