免疫營養(yǎng)對燙傷鼠腸粘膜的保護(hù)作用及其在燒傷病人中的應(yīng)用.pdf

1、研究背景與總體思路　　燒傷后的應(yīng)激性變化可造成腸粘膜的缺血性損害，腸粘膜屏障的破壞，細(xì)菌和內(nèi)毒素就易于滲過腸粘膜屏障，作用于補體系統(tǒng)，產(chǎn)生數(shù)量眾多的降解產(chǎn)物，這些物質(zhì)可引起內(nèi)臟血流的進(jìn)一步下降，出現(xiàn)惡性循環(huán)。因此wilmore等提出了“腸道是應(yīng)激的中心器官”學(xué)說<'【1】>；認(rèn)為應(yīng)激時腸管呈短暫或長時間的屏障功能損害，腸粘膜萎縮、通透性增加，細(xì)菌和毒素穿越腸粘膜屏障移行到腸系膜淋巴結(jié)或其他遠(yuǎn)處臟器形成細(xì)菌易位，促進(jìn)了全身炎癥反應(yīng)綜合征

2、(SIRS)的發(fā)生，通過一系列級聯(lián)反應(yīng)可最終導(dǎo)致多器官功能不全綜合癥(MODS)。　　燒傷后腸道是高代謝反應(yīng)的中心器官之一，如沒有足夠的營養(yǎng)維護(hù)腸道結(jié)構(gòu)與功能，則腸粘膜屏障功能易受損害，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用發(fā)生障礙，以致內(nèi)臟蛋白質(zhì)過度消耗，免疫功能受抑制，創(chuàng)面愈合延遲，在缺乏腸道營養(yǎng)支持的前提下，加重了腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，以致全身感染和臟器功能受損。同時，燒傷后組織嚴(yán)重?fù)p毀，以及受劇烈應(yīng)激反應(yīng)時各種神經(jīng)內(nèi)分泌因素的影響，機體在糖、

3、蛋白質(zhì)、脂肪等代謝方面都發(fā)生一系列極為復(fù)雜的變化，一方面組織分解加劇，蛋白質(zhì)大量丟失，能量消耗增加，代謝率升高；另一方面機體恢復(fù)及創(chuàng)面修復(fù)時也需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)。因此對燒傷病人實行有效的營養(yǎng)支持，保護(hù)腸道粘膜，維持腸道屏障功能的完整性，減少細(xì)菌和內(nèi)毒素的易位，降低創(chuàng)傷后高代謝反應(yīng)，改善機體的營養(yǎng)狀態(tài)已成為燒傷治療中的一個主要環(huán)節(jié)之一。　　近十年來，隨著臨床營養(yǎng)學(xué)的發(fā)展和對機體代謝的深入認(rèn)識，免疫營養(yǎng)(immunonutrition)的

4、概念逐漸受到重視。眾多的研究顯示它根據(jù)臟器組織不同的代謝特征進(jìn)行代謝調(diào)理，并強調(diào)特殊營養(yǎng)素的營養(yǎng)效應(yīng)，利用其藥理作用達(dá)到調(diào)節(jié)機體代謝和提高免疫功能的目的。應(yīng)用免疫營養(yǎng)能降低外科手術(shù)后感染并發(fā)癥的發(fā)生率，改善危重患者膿毒癥及MODS發(fā)生率，縮短平均住院時間與ICU住院時間，減少機械通氣時間及SIRS持續(xù)時間，并可降低住院費用。但也有的學(xué)者提出在某些疾病狀態(tài)下與傳統(tǒng)的腸內(nèi)營養(yǎng)比較無明顯優(yōu)勢，甚至能加重病情、增加死亡率<'[2]>。　　為了

5、全面評估早期腸內(nèi)免疫營養(yǎng)的效果及了解其可能的作用機制，我們設(shè)計了本實驗，于燒傷后早期開展腸內(nèi)免疫營養(yǎng)支持，第一部分主要研究免疫營養(yǎng)對實驗大鼠腸道免疫屏障的重要成員Peyer’s結(jié)的影響；第二部分研究其對腸粘膜細(xì)胞重要的信號分子p-ERKl/2及腸道機械屏障的影響并探討其可能的作用機制；第三部分研究添加谷氨酰胺的腸內(nèi)營養(yǎng)支持對燒傷病人傷后機體的營養(yǎng)和免疫狀況的影響，探索改善燒傷病人愈后的新途徑及可能性機制，為臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)?！?/p>

6、　第一部分　　早期腸內(nèi)免疫營養(yǎng)對燙傷大鼠Peyer’s結(jié)淋巴細(xì)胞亞群的影響目的利用燙傷的動物模型，通過對燙傷大鼠傷后早期腸內(nèi)不同營養(yǎng)內(nèi)容支持，觀察傷后不同時間Peyer’s結(jié)細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞亞群在營養(yǎng)支持影響下的變化形式，了解Peyer’s結(jié)內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4及IL-10產(chǎn)生的變化。 方法選取健康Wistar大鼠隨機分為鼠飼料組(Chow group)、標(biāo)準(zhǔn)腸內(nèi)營養(yǎng)組(EN group)和免疫營養(yǎng)組(EIN gro

7、up)，制成燙傷動物模型(30％TBSA Ⅲ<'。>燙傷)，傷后早期分別給予鼠飼料、標(biāo)準(zhǔn)腸內(nèi)營養(yǎng)制劑(能全力)和腸內(nèi)免疫營養(yǎng)制劑(士強)，于傷后第1、4、7、10天觀察Peyer’s結(jié)細(xì)胞總數(shù)及流式細(xì)胞儀細(xì)胞亞群分析(CD3<'+>、CD45Ra<'+>、CD4<'+>、 CD8<'+>)；Peyer’s結(jié)淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)24h檢測其細(xì)胞因子分泌的變化。結(jié)果　燙傷后Peyer’s結(jié)淋巴細(xì)胞總數(shù)在傷后1d明顯減少，主要體現(xiàn)為B細(xì)胞總數(shù)的

8、減少，EIN組在傷后7d時淋巴細(xì)胞總數(shù)恢復(fù)至傷前水平(P>0.05)，而其余兩組沒有恢復(fù)；EIN組B細(xì)胞在7d、10d時與傷前比較無明顯差異(P>0.05)，而Chow組、EN組B細(xì)胞總數(shù)在10d時與傷前比較明顯減少(P<0.05)；CD<'4+>和CD<'8+>細(xì)胞在傷后三組變化不明顯。燒傷后1d時三組IFN-γ的表達(dá)明顯上升(與傷前比較P<0.01)， EIN組在4、7、10d時明顯低于Chow、EN組(P<0.05)；EIN組在4

9、、7、10d時IL-4、IL-10表達(dá)高于Chow、EN組。提示EIN能促進(jìn)Peyer’s結(jié)淋巴細(xì)胞IL-4、IL-10的表達(dá)?！　〗Y(jié)論 燙傷能引起Peyer’s結(jié)內(nèi)細(xì)胞明顯減少，這種變化形式體現(xiàn)為B細(xì)胞為主要損害對象，其總數(shù)明顯減少；腸內(nèi)免疫營養(yǎng)支持能快速有效地促進(jìn)Peyer’s結(jié)淋巴細(xì)胞增殖，尤其是B細(xì)胞，增加Peyer’s結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞總數(shù)；能通過促進(jìn)Th2細(xì)胞因子的分泌糾正腸道局部Th2向Th1漂移的免疫偏差，有利于腸道免疫屏障

10、的恢復(fù)和強化。 第二部分 早期腸內(nèi)免疫營養(yǎng)對燙傷大鼠腸粘膜細(xì)胞p-ERK1／2通路及緊密連接的影響 目的 對燒傷后大鼠早期腸內(nèi)補給含多種免疫營養(yǎng)素的腸內(nèi)營養(yǎng)制劑，觀察其對MAPK／ERK的活性形式p-ERK1／2的激活作用及緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin和Z0-1的影響，探討腸內(nèi)免疫營養(yǎng)補給與ERK信號途徑的關(guān)系及其可能的作用機制。 方法 選取健康wistar大鼠隨機分為鼠飼料組、標(biāo)準(zhǔn)腸內(nèi)營養(yǎng)組

11、和免疫營養(yǎng)組，制成燙傷動物模型(30％TBSAⅢ<'0>燙傷)，傷后早期分別給予鼠飼料、標(biāo)準(zhǔn)腸內(nèi)營養(yǎng)制劑(能全力)和腸內(nèi)免疫營養(yǎng)制劑(士強)，于第1、4、7、10天觀察血漿D-乳酸、腸粘膜細(xì)胞p-ERK1／2的表達(dá)分布以及緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白Occludin和Z0-1表達(dá)的變化。 結(jié)果 (1)燒傷后血漿D-乳酸水平升高，Chow、EN組在觀察時間內(nèi)血漿D-乳酸濃度明顯高于傷前水平(P<0.05)，EIN組血漿D-乳酸濃度在傷后4d

12、恢復(fù)至傷前水平。(2)p-ERK1／2染色顯示燒傷后腸粘膜陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，EIN組隱窩和絨毛陽性細(xì)胞百分比在4d、7d明顯高于EN組和Chow組(P<0.05)。western blotting半定量分析顯示EIN組傷后p-ERKl/2表達(dá)升高，在4d、7d時明顯高于EN和Chow組(P<0.05)。(3)Western blotting半定量分析顯示EIN組傷后Occludin表達(dá)先下降后上升，在4d、7d時明顯高于EN和Cho

13、w組(P<0.05)。(4)ZO-1mRNA的RT-PCR分析顯示燒傷后1d時三組Z0-1mRNA表達(dá)均明顯下降(與傷前比較(P<0.05)，4d時EIN組與EN和Chow組比較明顯高于后者(P<0.05)，其余時間點各組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 燙傷能引起腸粘膜細(xì)胞p-ERK快速的活化，但其表達(dá)逐漸減弱。腸內(nèi)免疫營養(yǎng)支持能促進(jìn)p-ERK在腸絨毛和隱窩細(xì)胞高表達(dá)，從而對細(xì)胞的增殖和分化及功能狀態(tài)進(jìn)行調(diào)控；燙傷能引起TJ結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)

14、ccludin、Z0-1表達(dá)的減弱，從而引起腸粘膜通透性升高，腸粘膜屏障功能的損害。腸內(nèi)免疫營養(yǎng)支持能快速逆轉(zhuǎn)燒傷后TJ結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin、ZO-l表達(dá)下降，從而上調(diào)腸粘膜的屏障功能。這也可能是免疫營養(yǎng)改善燒傷后腸道功能的主要機制之一。相對于標(biāo)準(zhǔn)腸內(nèi)營養(yǎng)制劑，在維護(hù)燒傷后腸屏障功能方面，腸內(nèi)免疫營養(yǎng)的優(yōu)勢明顯。 第三部分添加谷氨酰胺的腸內(nèi)營養(yǎng)對燒傷病人的免疫調(diào)理作用 目的 為明確免疫營養(yǎng)在燒傷病人中的效果，我們以

15、本院燒傷科病人為研究對象，觀察燒傷后添加谷氨酰胺的腸內(nèi)營養(yǎng)支持對病人免疫和營養(yǎng)狀況的影響，客觀評價腸內(nèi)免疫營養(yǎng)的效果，為臨床開展免疫營養(yǎng)支持提供理論依據(jù)。 方法 選取2005年4月至2006年4月在我院燒傷科住院臨床燒傷病人24例，入選病人按隨機表(由隨機軟件NDST提取)隨機分為兩組：EN組，即腸內(nèi)飼以標(biāo)準(zhǔn)腸內(nèi)營養(yǎng)制劑能全力(n=12)；EIN組，即腸內(nèi)飼以谷氨酰胺+能全力(n=12)。于傷后第1、4、7、10天均在清晨空腹抽

16、血，檢測TP、AL和TF的濃度以及血漿IgG、 IgA、IgM的濃度；流式細(xì)胞儀分析外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>的百分比和CD4<'+>／CD8<'+>的比值。結(jié)果(1)在傷后各個時間點兩組患者TP、AL和TF濃度比較差異無顯著性意義(P>0.05)；在傷后4d、7d和10d時EIN組PA濃度明顯高于EN組(P<0.05)。 (2)在燒傷后各個時間點兩組患者外周血CD3<'+>細(xì)胞CD8<'+>

17、細(xì)胞百分比比較兩者差異不明顯(P>0.05)；在7d、10d時EIN組CD4<'+>百分比明顯高于EN組(P<0.05)。CD4<'+>／CD8<'+>的比率方面，在傷后1d和4d時兩組比較差異無顯著性意義(P>0.05)，但在7d和10d時E工N組比率明顯高于EN組(P<0.05)。 (3)在傷后7d、10d時EIN組IgA、IgG濃度明顯高于EN組(P<0.05)，其他時間點兩組比較差異不明顯(P>0.05)；在各個時間點比較兩組