5-溴脫氧尿嘧啶核苷對(duì)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外標(biāo)記的研究.pdf

1、目的 建立成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外分離培養(yǎng)和鑒定的方法，探討連續(xù)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記的穩(wěn)定性、最佳時(shí)間和劑量，爭(zhēng)取確定應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行研究最好的示蹤指標(biāo)。 方法 采集成人骨髓10mL，密度梯度法分離出單個(gè)核細(xì)胞；貼壁篩選法培養(yǎng)純化和擴(kuò)增MSCs；倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；取生長(zhǎng)良好的P3細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞的表面抗原(CD44、CD7

2、1、CD34、HLA-DR)；收集生長(zhǎng)良好的P1、P3、P5成人骨髓MSCs，用1Oμmol/L濃度的BrdU標(biāo)記至細(xì)胞生長(zhǎng)融合，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)標(biāo)記率(LI)；選擇P3細(xì)胞，以5、10、15/μmol/L濃度的BrdU分別標(biāo)記12、24、48、72、96h；檢測(cè)不同時(shí)間不同濃度的標(biāo)記率；將10μmol/LBrdU標(biāo)記72h的P3細(xì)胞連續(xù)傳代，觀察傳代后的細(xì)胞形態(tài)及增殖情況。 結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的成人骨髓M

3、SCs形態(tài)均一，為梭形或紡錘形的成纖維細(xì)胞樣外觀； FCM檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)CD44和CD71，不表達(dá)CD34和HLA-DR；大部分MSCs經(jīng)BrdU標(biāo)記后核抗BrdU染色陽(yáng)性，P1、P3、P5各代間不會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加而降低標(biāo)記率；隨著標(biāo)記濃度的升高和標(biāo)記時(shí)間的延長(zhǎng)，標(biāo)記率逐漸增高，濃度10μmol/L標(biāo)記72h標(biāo)記率在90％以上；標(biāo)記細(xì)胞連續(xù)傳代，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。結(jié)論密度梯度離心、貼壁培養(yǎng)和消化控制相結(jié)合的方法是體外分離培養(yǎng)人骨髓M