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文檔簡介
1、本文分兩部分,第一部分,目的:強力霉素(Doxycycline,Dox)屬于四環(huán)素類的抗生素,本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)其可促進小鼠胸腺上皮細胞系(thymicmedullary-type epithelial cell line1,MTEC1)的增殖,本研究探討了Dox促進MTEC1分泌IL-6和GM-CSF的作用及其機制,為進一步探索Dox在免疫重建中可能的應用前景奠定基礎(chǔ)。
方法:運用定量PCR及ELISA方法,在mRN
2、A和蛋白質(zhì)水平上分析了Dox對MTEC1細胞表達IL-6和GM-CSF的調(diào)控作用,然后應用蛋白印跡技術(shù)(Western blot)對Dox處理后MTEC1細胞內(nèi)與IL-6和GM-CSF基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NF-KB磷酸化的p65(p-p65)的表達水平進行分析。最后,為了進一步評價p65及ERK通路對Dox促進MTEC1細胞分泌IL-6及GM-CSF的作用,分別采用p65磷酸化抑制劑BAY11-7082和ERK抑制劑U0126預先處理
3、MTEC1,繼而加入Dox處理MTEC1,以ELISA、定量PCR、Western blot等方法分析p65及ERK通路的作用。
結(jié)果:本研究發(fā)現(xiàn)Dox在mRNA及蛋白水甲上均可促進MTEC1細胞表達IL-6及GM-CSF,且具有時間及劑量依賴性。Western blot分析也顯示了類似的結(jié)果,p-p65蛋白水平顯著上升。隨著抑制劑BAY11-7082和U0126濃度的增加,Dox這種促分泌作用被逐漸抑制。
4、結(jié)論:Dox可通過NF-KB及MAPK/ERK信號通路促進MTEC1表達IL-6及GM-CSF。由于胸腺是T細胞發(fā)育的重要器官,而胸腺上皮細胞通過分泌細胞因子的方式對胸腺細胞的發(fā)育又具有重要的調(diào)控作用。因此Dox可能具有通過促上皮細胞的細胞因子分泌作用從而促進T細胞的重建,但尚需進一步的探索。
第二部分,目的:制備抗脯氨酸富含區(qū)缺失的人FOXP3(delete rich prolinedomain of human FOX
5、P3,△PRD-hFOXP3)的單克隆抗體(mAb),為進一步研究人FOXP3各片段功能奠定基礎(chǔ)。
方法:以純化的△PRD-hFOXP3重組蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞Sp2/0進行常規(guī)融合,經(jīng)篩選及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb雜交瘤細胞株;利用核型分析、間接ELISA及Western blot分別鑒定了雜交瘤的細胞核型、抗體的效價與特異性。
結(jié)果:篩選
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