MHC Ⅰ-肽復(fù)合體及其多聚體簡(jiǎn)便高效制備方法的研究.pdf

1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）在清除和控制病原體的感染和傳播，監(jiān)視和殺傷腫瘤細(xì)胞以及介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生中起著十分重要的作用。MFICⅠ-肽（pMHCⅠ）四聚體技術(shù)因其具有很高的靈敏度和特異性；受檢CTL不需體外增殖、無(wú)損傷性；能同時(shí)直接對(duì)特異性CTL進(jìn)行定性、定量分析和分離純化等優(yōu)點(diǎn)而成為抗原特異性T細(xì)胞定量的金標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的pMHcⅠ四聚體制備包括以下三個(gè)過(guò)程：MHCⅠ重鏈、β2m蛋白的表達(dá)和抗原肽的合成；MHCⅠ-肽復(fù)合體的制備與純

2、化；MHCⅠ-肽復(fù)合體的生物素化和多聚體的制備。在這三個(gè)過(guò)程中存在三個(gè)技術(shù)局限，分別是：①M(fèi)HCⅠ-肽復(fù)合體的制備需要合成抗原肽，步驟繁瑣；②復(fù)性過(guò)程所片j時(shí)間較長(zhǎng)，復(fù)性產(chǎn)量低；⑨基于生物素和鏈酶親和素系統(tǒng)的MHCⅠ-肽四聚體法需要生物素化及多聚化過(guò)程，試劑昂貴，操作較煩瑣，需要后繼的純化與濃縮等步驟。以上技術(shù)局限限制了pMHCⅠ四聚體技術(shù)在免疫學(xué)和分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域的應(yīng)用。
　　 以上三個(gè)技術(shù)局限中，有六個(gè)具體的問(wèn)題有待研究

3、和解決：①pMHCⅠ四聚體的技術(shù)改進(jìn)之一是Uger等研究者建立的肽和β2m（β-β2m）融合表達(dá)策略制備pMHCⅠ復(fù)合體的方法，但在p-β2m重組質(zhì)粒的構(gòu)建中其基因第一位核苷酸受插入位點(diǎn)的限制；②重組蛋白能否在大腸桿菌中以可溶性的形式表達(dá)；③蛋白鑒定中Western blot實(shí)驗(yàn)的儀器化操作；④pMHCⅠ復(fù)合體濃縮和純化簡(jiǎn)便方法的研究；⑤高效簡(jiǎn)便復(fù)性方法的開(kāi)發(fā)；⑥pMHCⅠ多聚體簡(jiǎn)便制備方法的研究。
　　 本研究選取一段腫瘤抗原

4、肽CEA694-702和一段病毒抗原肽 HBc18-27，采用肽和β2m融合表達(dá)的策略制備MHC-CEA694-702和MHC-HBc18-27復(fù)合體及其多聚體，并對(duì)以上6個(gè)方而的問(wèn)題進(jìn)行較全面的研究。結(jié)果如下：
　　 1.所設(shè)計(jì)的同尾酶酶切-連接策略克服了插入基因序列第一個(gè)核苷酸的限制，使構(gòu)建肽和β2m融合基因更加靈活方便。在p-β2m基因中不含所涉及的酶切位點(diǎn)時(shí)，結(jié)合不對(duì)稱酶方法，可以將任意p-β2m基因插入到任意質(zhì)粒的任意

5、酶切位點(diǎn)中，而沒(méi)有目的基因起始核苷酸的限制。通過(guò)常規(guī)酶切-連接方法成功構(gòu)建了5種重組質(zhì)粒，分別是：pET32a-Trx-HIS-HC-BSP、pET28a-HC-BMP-HIS、pET28a-HC-HIS、pET28a-CEA694-702-β2m-HIS和pET28a-CEA694-702-β2m；通過(guò)同尾酶技術(shù)構(gòu)建成1種重組質(zhì)粒pET28a-HBc18-27-β2m。這6種重組質(zhì)粒含有序列正確的目的基因，可以在BL21（DE3）中誘

6、導(dǎo)出相應(yīng)的蛋白。
　　 2.在宿主菌BL21（DE3）中三種MHC重鏈蛋白（Trx-HIS-HC-BSP、HC-BSP-HIS和HC-BMP-HIS）和兩種p-β2m蛋白（CEA694-702-β2m-HIS和CEA694-702-β2m）在各誘導(dǎo)條件下均主要以包涵體形式表達(dá)，且誘導(dǎo)條件的不同對(duì)胞質(zhì)可溶性形式表達(dá)的目的蛋白的絕對(duì)量影響不大。以包涵體形式表達(dá)的目的蛋白的量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加。采用高壓均質(zhì)法破菌提取包涵體并經(jīng)初

7、步純化后，三種MHC重鏈蛋白（HC-BSP-HIS、HC-BMP-HIS和HC-HIS）的產(chǎn)量在25 mg/L培養(yǎng)基以上，三種p-β2m融合蛋白（CEA694-702-β2m-HIS、CEA694-702-β2m和HBc18-27-β2m）的產(chǎn)量在50 mg/L，培養(yǎng)基以上；六種蛋白的純度均在85％以上：經(jīng)Wetern blot鑒定蛋白表達(dá)正確。
　　 3.所設(shè)計(jì)并申請(qǐng)專利的蛋白雜交洗脫儀具有節(jié)省時(shí)間和人力、節(jié)省抗體、可規(guī)模操作

8、、結(jié)果重復(fù)性好和雜交效率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種Western blot試驗(yàn)很好的工具。
　　 4.運(yùn)用CEA694-702-β2m-HIS和HBc18-27-β2m蛋白分別制備出結(jié)構(gòu)和構(gòu)象正確的MHC-CEA694-702復(fù)合體和MHC-HBc18-27復(fù)合體，與常規(guī)的MHC HC、β2m和抗原肽三個(gè)單位的復(fù)合體制備方法相比，這種肽和β2m融合策略更簡(jiǎn)便易行，節(jié)省成本。利用離子交換色譜同時(shí)濃縮和純化了MHC-HBc18-27復(fù)合體，方

9、法快速方便，處理效率高。
　　 5.將HC-BSP-HIS和CEA694-702-β2m-HIS同時(shí)結(jié)合在IMAC色譜上進(jìn)行復(fù)性不能得到純的MHC-CEA694-702復(fù)合體。利用pull-down式復(fù)性方法，通過(guò)IMAC復(fù)性了兩種MHC-CEA694-702復(fù)合體：MFC-CEA（BSP）和MHC-CEA（BMP），其中MHC-CEA（BSP）復(fù)合體通過(guò)尺寸排阻色譜、離子交換色譜和反相高效液相色譜三種色譜方法分析結(jié)果表明復(fù)合體

10、結(jié)構(gòu)正確。進(jìn)一步，利用我們已申請(qǐng)專利的pull-down式復(fù)性方法，通過(guò)IEC復(fù)性了兩種pMHCⅠ復(fù)合體：MHC-CEA694-702復(fù)合體和MHC-HBc18-27復(fù)合體；通過(guò)尺寸排阻色譜分析，這兩種復(fù)合體結(jié)構(gòu)正確，純度分別為88％和82％；通過(guò)Dot-ELISA和FACS進(jìn)行構(gòu)象鑒定，結(jié)果表明 MHC-CEA694-702復(fù)合體構(gòu)象正確。
　　 6.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HC-BMP-HIS可以結(jié)合鏈酶親和素（SA），并初步表明帶BMP-

11、tag的蛋白分子可以在SA的作用下形成多聚體。HC-BSP-HIS蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)被部分生物素化；在2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)HC-BSP-HIS包涵體的產(chǎn)量較高，而在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)HC-BSP-HIS的生物素化效率較高；當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度為10 mg/mL時(shí)，HC-BSP-HIS的包涵體產(chǎn)量和生物素化效率最高；培養(yǎng)基中生物素的濃度對(duì)HC-BSP-HIS的包涵體產(chǎn)量和生物素化效率均無(wú)明顯影響；在37℃和24℃時(shí)，HC-BSP-

12、HIS的包涵體的產(chǎn)量均隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，其中37℃誘導(dǎo)24 h時(shí)包涵體產(chǎn)量最高，而在37℃誘導(dǎo)6 h時(shí)HC-BSP-HIS生物素化效率最高，為25％；多聚體形成實(shí)驗(yàn)初步表明，部分生物素化的BSP-tag比BMP-tag與SA的多聚化能力要高。通過(guò)抗His-tag抗體及PE標(biāo)記的抗IgG抗體可以將稀釋復(fù)性法制備的MHC-HBc18-27復(fù)合體制備成MHC-HBc18-27多聚體，并能成功地檢測(cè)到乙型肝炎病毒患者PBM中的HBc18

13、-27-特異性CTL。這種抗體型pMHC多聚體的方法簡(jiǎn)單，制備方便，是一種具有應(yīng)用潛力的多聚化方法。pull-down式IEC復(fù)性法通過(guò)抗體作用形成MHC-HBc18-27多聚體后也可以成功地檢測(cè)到乙型肝炎病毒患者PBMC中的HBc18-27-特異性CTL，其檢測(cè)結(jié)果與稀釋復(fù)性法制備的MHC-HBc18-27多聚體檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明pull-down式IEC復(fù)性法復(fù)性可得到具有功能活性的MHC-HBc18-27復(fù)合體。
　　 以

14、上結(jié)果提示：利用同尾酶技術(shù)可以解決p-β2m構(gòu)建中的基因序列第一個(gè)核苷酸的限制，拓寬了肽和β2m融合表達(dá)策略的應(yīng)用范圍；pull-down式復(fù)性方法可以成功地制備pMHCⅠ復(fù)合體，方法簡(jiǎn)便，復(fù)性效率高，復(fù)性、濃縮和純化過(guò)程集合在一起；抗體犁多聚體技術(shù)是一種簡(jiǎn)單有效的多聚化方法，可以成功制備出具有功能活性的pMHCⅠ多聚體。這些研究不但簡(jiǎn)化了肽和β2m融合表達(dá)策略下的pMHCⅠ多聚體的構(gòu)建并提高其制備效率和降低了制備成本，而且為優(yōu)化常規(guī)的