豬苓利尿機制及其活性成分在大鼠體內(nèi)藥代動力學研究.pdf

1、目的:
　　1研究豬苓對正常大鼠血漿醛固酮(ALD)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、抗利尿激素(ADH)及心鈉素(ANP)的影響，探討豬苓多靶點利尿機制，為豬苓今后臨床科學使用提供重要依據(jù)。
　　2研究豬苓不同劑量與不同給藥次數(shù)對大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和血管緊張素Ⅱ受體1的影響，進一步探討豬苓產(chǎn)生利尿作用的藥理機制。
　　3建立同時測定豬苓中麥角甾酮與麥角甾醇的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，為中藥豬苓提供質(zhì)量控制檢測方法。

2、
　　4建立HPLC-APCI/MS/MS法同時檢測豬苓給藥后大鼠血漿中麥角甾酮與麥角甾醇，并檢測分析兩者血藥濃度變化，運用數(shù)學模型擬合，進行豬苓給藥后大鼠體內(nèi)藥代動力學的研究。
　　5建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大鼠給予豬苓低中高三劑量后，麥角甾酮與麥角甾醇在大鼠尿液中的含量，繼續(xù)探討豬苓中麥角甾酮與麥角甾醇在尿液中排泄情況。
　　方法:
　　1將篩選合格雄性SD大鼠60只隨機分為給藥2d組與給藥8d組。每組分

3、為生理鹽水組(NS)、呋塞米組、豬苓（低、中、高劑量）組，每組6只。每日分別灌胃等體積生理鹽水10 mL·kg-1、呋塞米0.1g·kg-1、豬苓低劑量組18.9 g·kg-1、豬苓中劑量組56.7 g·kg-1、豬苓高劑量組94.5 g·kg-1，分別連續(xù)給藥2d與8d。采用放射免疫方法檢測大鼠血漿醛固酮(ALD)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、抗利尿激素(ADH)與心鈉素(ANP)含量。
　　2篩選尿量、尿Na+、尿K+、尿Cl-

4、四個指標均在正常范圍內(nèi)的大鼠42只，分為生理鹽水組(NS)、呋塞米組、卡托普利組、氯沙坦組、豬苓低劑量組、豬苓中劑量組、豬苓高劑量組，每組大鼠6只。每日分別灌胃給予等體積生理鹽水10 mL·kg-1、呋塞米0.1 g·kg-1、卡托普利0.63 g·kg-1、氯沙坦0.315 g·kg-1豬苓低劑量組18.9g·kg-1、中劑量組56.7 g·kg-1、豬苓高劑量組94.5 g·kg-1，連續(xù)灌胃給藥8天，每日1次。分別于第一次給藥后2

5、4 h、第2次給藥后24 h、第8次給藥后24 h分別眼眶靜脈叢取血，并采用ELISA試劑盒進行檢測。
　　3采用超聲提取方法制備供試品溶液，以Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1 mm×150mm，3.5μ m)色譜柱進行分離，流動相為甲醇∶10 mmoL·L-1醋酸銨緩沖液(98∶2，V/V)，流速0.4 mL·min-1。試樣在三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜中經(jīng)過大氣壓化學離子化(APCI)離子源，在正離子方式下采用多反

6、應離子監(jiān)測(MRM)模式進行檢測。
　　4豬苓灌胃給藥并于眼底靜脈叢采血，血漿樣本經(jīng)乙酸乙酯萃取處理，以β-蛻皮甾酮作為內(nèi)標，優(yōu)化相關質(zhì)譜與色譜條件，建立同時檢測血漿總麥角甾酮與麥角甾醇的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，進行血漿樣本檢測分析，數(shù)據(jù)采用內(nèi)標法進行定量分析，做方法學驗證。藥代動力學采用WinNonlin軟件進行麥角甾酮與麥角甾醇模型模擬擬合，結(jié)合兩者藥時曲線，計算相關藥代動力學參數(shù)。
　　5篩選合格實驗大鼠24只，

7、隨機分成豬苓低中高三劑量組，每組大鼠8只，于代謝籠，每組每只按2 mL·100g-1灌胃給予豬苓低中高三劑量，給藥后，分別于給藥后0-2、2-4、4-8、8-12、12-24、24-36、36-48、48-60 h時間段內(nèi)收集尿液，采用稀釋法制備尿液樣本。優(yōu)化高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，做方法學確證，并對尿液樣本進行檢測分析，繪制尿藥濃度-時間曲線與累計尿排量-時間曲線。
　　結(jié)果:
　　1與NS組相比，豬苓給藥2d組與8d組

8、均有明顯利尿作用，且豬苓高劑量組利尿活性與呋塞米組作用相當;豬苓低中高三劑量組ALD、AngⅡ、ADH含量均明顯降低，ANP水平升高，并且豬苓給藥8d組與給藥2d組相比，給藥8d組各指標變化水平明顯高于給藥2d組（P＜0.05），其中，給藥8d豬苓高劑量組的ALD、ANP變化幅度最大，較NS組分別變化56.7％與69.2％;豬苓中劑量組ADH含量的降低作用較為明顯，較NS組降低50.8％，而對于上述4個指標，呋塞米組給藥2d和給藥8d組

9、的變化水平并不顯著。
　　2豬苓對正常大鼠血液中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和血管緊張素Ⅱ1型受體1(AT1)的影響
　　2.1豬苓對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的影響
　　與生理鹽水組相比，卡托普利組、豬苓低中高給藥組大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶水平明顯降低，且降低水平隨給藥天數(shù)的增加而升高。與卡托普利組相比，給藥1天后，豬苓各給藥組大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶降低水平低于卡托普利組;豬苓低中高三劑量組相比，降低水平相差不大;豬苓給藥2天后，高劑

10、量對大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制作用與卡托普利作用相當;豬苓低中高三劑量組相比，抑制作用呈一定的劑量依賴性;給藥8天后，豬苓低中高三給藥組抑制作用明顯增加，其低劑量組與卡托普利組相比無明顯差異，中高劑量抑制作用均強比卡托普利，三給藥組降低水平呈一定的劑量依賴性。
　　2.2豬苓對血管緊張素Ⅱ1型受體1的影響
　　與生理鹽水組相比，氯沙坦組與豬苓低中高劑量組大鼠血管緊張素Ⅱ受體1水平均呈降低;給藥1天與給藥2天后，與氯沙坦組相比，

11、豬苓低中高給藥組大鼠血管緊張素Ⅱ受體1降低水平均低于氯沙坦組;給藥8天后，豬苓三劑量組大鼠血管緊張素Ⅱ受體1明顯降低，并呈一定的劑量依賴性。
　　3中藥豬苓中麥角甾酮與麥角甾醇在1-3000 ng·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好，麥角甾酮和麥角甾醇的平均加樣回收率分別為100.8％和100.7％，日內(nèi)和日間變異(RSD)均小于6.5％，色譜峰保留時間分別為4.2 min和4.6 min。
　　4血漿中麥角甾酮與麥角甾醇分

12、別在1-3000 ng·mL-1、3-3000 ng· mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關系。麥角甾酮低中高3種濃度質(zhì)控樣品相對回收率分別為(95.8±8.5)％、(96.0±4.4)％、(95.5±3.5)％(n=15)，提取回收率分別為(68.3±9.1)％、(91.5±6.5)％、(85.5％±4.4)％(n=5)。麥角甾醇低中高3種濃度質(zhì)控樣品相對回收率為(97.3±7.7)％，(100.7±8.9)％，(101.4±7.5)％(n=

13、15)，提取回收率分別為(68.7±10.5)％，(90.6±13.3)％，(90.6±8.5)％，(n=5)。麥角甾酮與麥角甾醇日內(nèi)精密度、日間精密度、穩(wěn)定性RSD值均小于15％。
　　大鼠灌胃給予豬苓低、中、高三劑量后，數(shù)據(jù)采用WinNonlin軟件進行分析處理，數(shù)據(jù)與一級吸收的一室開放模型匹配最佳。單次灌胃給予豬苓后，隨著劑量增加，麥角甾酮與麥角甾醇的藥時曲線下面積、血藥峰濃度及吸收速率常數(shù)均增大，中劑量組麥角甾酮與麥角甾醇

14、達峰時間最短，其半衰期最長。高劑量組麥角甾酮的表觀分布容積最大，而麥角甾醇在中劑量組中最大。低劑量組麥角甾酮平均滯留時間最長，中劑量麥角甾醇平均滯留時間最大。麥角甾酮與麥角甾醇的消除速率常數(shù)和清除率則隨劑量增加而增大，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。
　　5尿液中麥角甾酮與麥角甾醇在1-300 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好，兩者低中高3質(zhì)控樣品日內(nèi)精密度與日間精密度RSD值均小于10％，穩(wěn)定性RSD值小于15％。麥角甾酮低中高三濃度相對

15、回收率為(92.8±4.4)％、(98.6±7.3)％、(93.5±7.1)％(n=15)，提取回收率為(90.4±4.4)％、(89.0±3.3)％、(95.7±2.7)％，(n=5)，基質(zhì)效應為(96.0±0.2)％，(98.9±3.0)％，(95.1±1.2)％，(n=5)。麥角甾醇低中高三濃度相對回收率為(94.8±6.2)％、(98.8±5.8)％、(99.3±6.2)％(n=15)，提取回收率為(96.4±8.7)％、(92

16、.2±5.6)％、(93.5±2.1)％，(n=5)，基質(zhì)效應為(96.7±2.2)％,(99.9±4.7)％,(96.4±4.8)％,(n=5)。
　　尿液樣本分析麥角甾酮與麥角甾醇在尿液中以原型排泄在給藥后18 h達到最大排泄量，給藥后48-60 h時間段尿液中仍殘存少量麥角甾酮與麥角甾醇，整體排泄量隨中高三劑量呈明顯的劑量依賴性。
　　結(jié)論:
　　1血漿心鈉素、醛固酮、血管緊張素Ⅱ及抗利尿激素是參與調(diào)節(jié)體內(nèi)水液代

17、謝的重要因素，豬苓利尿作用可能與降低醛固酮、血漿緊張素Ⅱ及抗利尿激素含量，升高血漿心鈉素水平有關，且中藥豬苓起效時效長而明顯，為豬苓利水滲濕傳統(tǒng)功效與多靶點起效提供一定的科學依據(jù)。
　　2豬苓具有顯著的利尿活性，可降低血管緊張素Ⅱ、醛固酮、血管加壓素水平，其作用靶點可能在于抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、拮抗血管緊張素Ⅱ受體1，從而降低腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中相關激素水平，產(chǎn)生強大的利尿作用。
　　3本實驗建立的HPL

18、C-APCI-MS/MS法用時短、專屬性強，可以準確、靈敏、快速地檢測豬苓配方顆粒中出麥角甾酮與麥角甾醇的含量，對豬苓顆粒質(zhì)量控制和評價具有一定意義，為下一步深入研究其活性成分的藥理機制奠定基礎。
　　4所建高效液相質(zhì)譜檢測方法可高效、快速、靈敏并同時監(jiān)測豬苓給藥后大鼠血漿中麥角甾酮與麥角甾醇的含量，為研究豬苓藥代動力學提供科學準確的檢測方法。研究中單次給予中藥豬苓后，其主要活性成分麥角甾酮與麥角甾醇在大鼠體內(nèi)的藥代動力學行為以一

19、級動力學的房室開放模型擬合較好，更具體的對中藥豬苓在大鼠體內(nèi)的動力學變化情況加以詳細描述，其藥物動力學特征結(jié)合藥代動力學參數(shù)，為臨床治療所需有效血藥濃度選擇最佳劑量、給藥周期、負荷劑量的計算與設計最佳給藥方案提供一定的參考價值。
　　5實驗所建立的HPLC-MS/MS法高效、靈敏、特異性強，各項方法學驗證指標均滿足檢測要求，適用于中豬苓給藥后大量尿液樣本中麥角甾酮與麥角甾醇兩利尿活性物質(zhì)的檢測。根據(jù)實驗所建立的尿液檢測方法檢測各時