知母-黃柏藥對體內(nèi)化學成分及藥代動力學研究.pdf

1、目的:
　　1.研究知母-黃柏藥對在正常和糖尿病模型大鼠體內(nèi)成分;
　　2.建立芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C、知母皂苷N、知母皂苷BⅡ、黃柏堿、木蘭花堿7種成分的血藥濃度檢測方法，探討知母-黃柏藥對給藥后，7種成分在正常和糖尿病模型大鼠體內(nèi)藥代動力學行為差異;
　　3.研究黃柏堿在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物及代謝途徑。
　　方法:
　　1.采用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL技術(shù)，分析在知母-黃柏藥對給藥后

2、，正常和糖尿病大鼠體內(nèi)成分，糖尿病模型采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)一個月后腹腔注射35 mg·Kg-1鏈脲佐菌素(STZ)建立。
　　色譜條件:色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(150 mm×2.1mm，3.5μm);流動相A為含有0.1％甲酸的超純水，流動相B為乙腈;梯度洗脫，0～40 min，5％～14％B;40～60 min,14％～30％B;60～80 min,30％～50％B;80～90 min,50％～9

3、5％B;90～95 min，95％B;流速0.2 mL·min-1;柱溫30℃;PDA檢測波長范圍為200～600nm;前3 min進廢液。
　　質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧ESI源;使用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)模式;正離子模式電噴霧電壓為4 kV;負離子模式噴霧電壓為-3.5 kV;鞘氣(ShG)為45 arb;霧化溫度為325℃;輔助氣(AG)為5 arb;吹掃氣(SwG)0 arb;一級質(zhì)譜采用傅里葉變換質(zhì)譜(FTMS)掃描模式，

4、分辨率為30000;二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴掃描;分辨率為15000;碰撞能為35 eV。
　　鑒別方法:通過比較相同實驗條件下得到的知母-黃柏藥對水煎液的色譜質(zhì)譜信息，給藥后樣品與空白樣品以及對照品的色譜質(zhì)譜信息比較，對比參考文獻等方法加以確認。
　　2.通過UHPLC-LTQ-Orbitrap XL和島津液相色譜-API4000+型三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)，檢測芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C、知母皂苷N、知母皂

5、苷BⅡ、黃柏堿、木蘭花堿7種成分在正常和糖尿病組大鼠體內(nèi)血藥濃度。正常和糖尿病大鼠各6只，采用單次灌胃給藥知母-黃柏藥對水提物凍干粉0.16 g·Kg-1的CMC-Na混懸液（芒果苷9.36 mg· Kg-1、新芒果苷18.592 mg· Kg-1、知母皂苷BⅡ85.84 mg· Kg-1、知母皂苷N3.68 mg·Kg-1、知母皂苷C5.104 mg·Kg-1、黃柏堿3.856 mg· Kg-1、木蘭花堿0.885 mg·Kg-1）后

6、，測定給藥后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、11和24 h正常和糖尿病大鼠各成分血藥濃度，用DAS軟件計算各成分的藥代動力學參數(shù)，并用SPSS統(tǒng)計相關(guān)參數(shù)，比較兩組間差異。
　　黃柏堿、木蘭花堿的測定:采用島津液相色譜-API4000+型三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)，內(nèi)標為烏頭堿，采用甲醇沉淀蛋白法處理樣品。色譜柱為ZORBAXEclipse XDB-C18柱(2.1×150mm，5μm)

7、;流動相A為0.1％甲酸水，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0-1 min，10％-60％B;1-6min60％B），流速0.2 mL·min-1，柱溫30℃，進樣量10μ L。離子源為電噴霧ESI源，噴霧電壓IS為4000 V;霧化溫度為450℃;氣簾氣CUR為40;碰撞氣CAD為10;霧化氣GAS1為50;檢測方式為正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，用于定量分析的離子對分別為342.3→297.2（木蘭花堿），342.3→192.1（黃柏堿

8、）。
　　芒果苷、新芒果苷、知母皂苷N、知母皂苷C、知母皂苷BⅡ的測定:采用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL技術(shù)，內(nèi)標人參皂苷Rg2，采用甲醇沉淀蛋白法處理樣品。色譜柱為CORTECS(@)UPLC(@)C18（2.1×100mm，1.6μ m），流動相A為0.1％甲酸水，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0-10 min，6-30％，前2.5 min進廢液;10-18 min，30-40％;18-20min，40-90％），流

9、速0.2 mL·min-1，柱溫30℃，進樣量10μL，分析時間20min。離子源為電噴霧ESI源，碰撞誘導(dǎo)解離(CID)檢測模式，電噴霧電壓為3.5KV，鞘氣(ShG)為45 arb，霧化溫度為325℃，輔助氣(AG)為5 arb，吹掃氣(SwG)0 arb，分辨率為30000，質(zhì)量掃描范圍m/z為200-1200。
　　3.采用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL技術(shù)，在灌胃給藥黃柏堿80 mg·Kg-1后，檢測大鼠血漿

10、、膽汁、尿液和糞便中所含的代謝產(chǎn)物。色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1×150mm，3.5μm);流動相A為0.1％的甲酸，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0～40 min，5％～14％B，前3 min進廢液），流速0.2 mL·min-1，柱溫30℃。離子源為電噴霧ESI源，檢測方式為正離子碰撞誘導(dǎo)解離(CID)模式，電噴霧電壓為4.5KV;鞘氣(ShG)為45 arb，霧化溫度為325℃，輔助氣(AG)為5 a

11、rb，吹掃氣(SwG)0 arb，碰撞能為30 eV。MS1采用傅里葉變換質(zhì)譜(FTMS)，分辨率為30000，質(zhì)量掃描范圍為215-900。MS2和MS3采用數(shù)據(jù)依賴掃描(DDS)，分辨率為15000。
　　代謝產(chǎn)物的鑒別:利用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL，比較給藥后樣品與空白樣品色譜圖，初步篩選可能的代謝產(chǎn)物峰，而根據(jù)已有的代謝生物轉(zhuǎn)化類型和黃柏堿的結(jié)構(gòu)逆向推測其可能的代謝產(chǎn)物分子量和分子結(jié)構(gòu)，然后在色譜和質(zhì)譜中

12、查看是否存在，若存在，則需要對其碎片信息進行考察，來確定其是否為黃柏堿的代謝產(chǎn)物。
　　結(jié)果:
　　1.通過本次研究，在知母-黃柏藥對給藥后，大鼠血漿中共鑒別了原型成分16個，其中檢測的黃酮類、皂苷類、有機酸類成分共10個，來源于知母;檢測的生物堿類成分6個，來源于黃柏;代謝產(chǎn)物11個，其中芒果苷類代謝產(chǎn)物6個，生物堿類代謝產(chǎn)物5個，正常組和糖尿病組大鼠所含成分種類無差別。
　　2.通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對芒果苷、新芒果苷

13、、知母皂苷BⅡ、知母皂苷N、知母皂苷C、黃柏堿、木蘭花堿7個主要成分血藥濃度檢測方法學考察，各成分在檢測條件下，線性關(guān)系良好，R均大于0.9958，準確度為(90.48±6.58)％-(108.54±5.71)％，日內(nèi)和日間精密度(RSD)均≤10.54％，各條件下穩(wěn)定性結(jié)果均在(87.92±2.24)％-(110.52±3.24)％之間，專屬性好。分別給予正常組和糖尿病組大鼠0.16 g·Kg-1知母-黃柏藥對水煎液凍干粉，由建立的定

14、量方法測得知母皂苷N和黃柏堿在糖尿病組大鼠的AUC0～t顯著大于正常組，而知母皂苷C和黃柏堿的Cmax在糖尿病組大鼠顯著高于正常組。
　　3.通過高分辨質(zhì)譜和LC-MSn技術(shù)，共鑒別了黃柏堿在體內(nèi)的25個代謝產(chǎn)物。其代謝形式主要有葡萄糖醛酸化、羥基化、脫氫、脫甲基、甲基化等。其中葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物主要鑒別于膽汁、尿液、血漿樣品中，羥基化和脫甲基化的代謝產(chǎn)物主要鑒別于糞便樣品中。
　　結(jié)論:
　　本文利用UHPLC-

15、LTQ-Orbitrap XL高分辨多級液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，在知母-黃柏藥對給藥后，鑒別正常和糖尿病大鼠血漿所含成分種類無差異。表明正常和糖尿病病理模型對知母-黃柏藥對中藥物成分進入血液中的種類無影響。但利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，研究芒果苷、新芒果苷等7個主要成分在正常和糖尿病大鼠中的藥代動力學行為，發(fā)現(xiàn):糖尿病大鼠中新芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷N、知母皂苷C和黃柏堿5個成分AUC0～t和Cmax均值均高于正常組，但無統(tǒng)計學意義;知母皂苷N的AU

16、C0～t和知母皂苷C的Cmax均值都是糖尿病組顯著高于正常組，而黃柏堿的AUC0～t和Cmax的均值在糖尿病大鼠均顯著高于正常組，說明糖尿病病理模型對部分成分的吸收和利用有影響，這可能與其發(fā)揮降糖藥理作用相關(guān)。由于黃柏堿在兩種生理模型下藥代動力學行為的差異顯著，本文利用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL高分辨多級液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，研究知母-黃柏藥對中代表性成分黃柏堿在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便樣品中的代謝情況，共鑒別黃柏堿的代謝產(chǎn)物