丙戊酸致乳腺癌細(xì)胞放射增敏作用及其同源重組修復(fù)的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病之一，并嚴(yán)重威脅到女性的身心健康。由此，乳腺癌的治療，特別是對(duì)乳腺癌的放射治療問(wèn)題一直備受全世界學(xué)者關(guān)注，如何增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)放射的敏感性更是該領(lǐng)域?qū)W者們關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。
　　丙戊酸(Valproic Acid，VPA)是一種含有8個(gè)碳原子的短鏈脂肪酸類(lèi)的組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors，HDACis)，它通過(guò)抑制組蛋白去乙酰

2、化酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞組蛋白高度乙酰化。臨床上VPA主要用于癲癇患者的治療，目前發(fā)現(xiàn)VPA不但對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，還發(fā)現(xiàn)高濃度的VPA（如5mmol/L）可以增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)放射的敏感性，提示VPA在乳腺癌放療中可能是一個(gè)潛在的放射增敏劑，深入研究還揭示VPA放射增敏作用的一個(gè)可能機(jī)制是破壞了DNA損傷修復(fù)機(jī)制。但VPA在臨床安全劑量范圍內(nèi)的放射增敏作用及其分子機(jī)制卻不十分清楚。
　　根據(jù)VPA治療癲癇病的安全血藥劑量

3、為0.3-0.8mmol/L，本課題選擇臨床安全劑量0.5mmol/L和臨界安全劑量1mmol/L的VPA，研究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7放射敏感性的影響;同時(shí)，同源重組(Homologous Recombination，HR)是DNA雙鏈斷鏈修復(fù)的一個(gè)重要機(jī)制，本課題還探討了VPA誘導(dǎo)的放射增敏作用中對(duì)HR修復(fù)的分子機(jī)制影響，目的在于為VPA用于臨床上治療乳腺癌患者提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.DNA雙鏈斷裂

4、標(biāo)志物γ-H2AX及HR修復(fù)關(guān)鍵蛋白R(shí)ad51和BRCA1表達(dá)的檢測(cè)
　　用VPA臨床安全劑量0.5 mmol/L和臨界安全劑量1 mmol/L分別預(yù)處理MCF7細(xì)胞24，48和72h后，給予8Gy電離輻射后恢復(fù)6h，用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)觀(guān)察γ-H2AX、Rad51和BRCA1蛋白表達(dá)，用免疫熒光方法觀(guān)察γ-H2AX、Rad51和BRCA1蛋白焦點(diǎn)形成情況。
　　2.MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VPA對(duì)MCF7細(xì)胞放射敏感性的變

5、化
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞，用VPA0.5和1 mmol/L分別預(yù)處理細(xì)胞72h，然后給予4Gy電離輻射后48h，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率;MCF7細(xì)胞用VPA0.5 mmol/L預(yù)處理24h后，根據(jù)每皿接種不同的細(xì)胞數(shù)目分別給予不同劑量的電離輻射照射:2Gy（500個(gè)/皿和1000個(gè)/皿）、4Gy（2000個(gè)/皿和4000個(gè)/皿）、6Gy（8000個(gè)/皿和16000個(gè)/皿），計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)量并計(jì)算克隆形成率。

6、　　3.HR修復(fù)效率的檢測(cè)
　　向帶有表達(dá)重組底物pDR-GFP的MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IsceI質(zhì)粒4h后，分別用VPA0.5和1 mmol/L處理MCF7細(xì)胞24h，收集細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定HR效率。
　　4.細(xì)胞周期的檢測(cè)
　　用VPA0.5和1mmol/L分別預(yù)處理MCF7細(xì)胞24，48和72h后，收集細(xì)胞，用冰乙醇固定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)前用PI染液進(jìn)行染色。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)答DNA損傷反應(yīng)時(shí)

7、，VPA對(duì)DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γ-H2AX的影響
　　蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VPA0.5和1mmol/L處理后，與正常對(duì)照組相比，γ-H2AX表達(dá)量均呈增加趨勢(shì);VPA預(yù)處理后再給予8Gy電離輻射處理，與單獨(dú)電離輻射組相比，γ-H2AX表達(dá)量增加更加明顯。
　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VPA單獨(dú)作用于MCF7細(xì)胞后，就能導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)顯著增加，并隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，焦點(diǎn)數(shù)目呈逐漸增加的趨勢(shì)。其中，VPA0.

8、5 mmol/L分別處理MCF7細(xì)胞24，48和72h后，與對(duì)照組γ-H2AX焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率（指＞10焦點(diǎn)/細(xì)胞，為5.51％）相比，分別又增加了5.30％(P＜0.05)，7.11％(P＜0.01)和12.24％(P＜0.01);VPA1 mmol/L分別處理MCF7細(xì)胞24，48和72h后，與對(duì)照組相比γ-H2AX焦點(diǎn)陽(yáng)性率變化與0.5 mmol/L處理組有相同趨勢(shì)，也分別增加了9.33％(P＜0.05)，13.91％（P＜0.01

9、）和17.38％(P＜0.01)。
　　VPA預(yù)處理MCF7細(xì)胞不同時(shí)間后分別給予8Gy電離輻射，恢復(fù)6h時(shí)發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞都有γ-H2AX焦點(diǎn)形成的表現(xiàn)，但根據(jù)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)形態(tài)將其分為兩類(lèi):A類(lèi)細(xì)胞（細(xì)胞含焦點(diǎn)相對(duì)較小且較暗的細(xì)胞，代表DNA損傷相對(duì)較輕）和B類(lèi)細(xì)胞（細(xì)胞含焦點(diǎn)相對(duì)較大且明亮的細(xì)胞，代表DNA損傷相對(duì)較重）。單獨(dú)電離輻射處理時(shí)γ-H2AX焦點(diǎn)的形態(tài)主要以A類(lèi)細(xì)胞為主，然而給予VPA預(yù)處理24h時(shí)就觀(guān)察到代表

10、損傷較重的B類(lèi)細(xì)胞所占比例明顯增加，隨預(yù)處理時(shí)間延長(zhǎng)，其比例進(jìn)一步顯著增加，呈時(shí)間依賴(lài)性。其中，VPA0.5 mmol/L分別預(yù)處理MCF7細(xì)胞24，48和72h后，與單獨(dú)照射組B類(lèi)細(xì)胞所占比例(16.51％)相比，分別增加了12.43％(P＜0.05)，41.46％(P＜0.01)和54.25％(P＜0.01);VPA1 mmol/L分別預(yù)處理MCF7細(xì)胞24，48和72h后，與單獨(dú)照射組相比B類(lèi)細(xì)胞所占比例的變化與0.5 mmol/

11、L處理組有相同趨勢(shì)，也分別增加了31.75％(P＜0.05),51.19％(P＜0.01)和54.92％(P＜0.01)。
　　2.VPA增強(qiáng)MCF7細(xì)胞對(duì)放射的敏感性
　　MTT與細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，VPA0.5和1mmol/L單獨(dú)作用于MCF7細(xì)胞后，與正常對(duì)照組相比均可顯著降低細(xì)胞克隆形成率(P＜0.05)。與單獨(dú)照射處理組相比，VPA0.5mmol/L預(yù)處理MCF7細(xì)胞后接受電離輻射能顯著降低細(xì)胞細(xì)胞克隆形成

12、率和細(xì)胞存活率(P＜0.05）;
　　3.VPA導(dǎo)致MCF7細(xì)胞HR修復(fù)功能障礙
　　與正常對(duì)照組相比，VPA處理組HR效率明顯降低:VPA0.5和1mmol/L處理MCF7細(xì)胞24h后與對(duì)照組相比，HR效率分別降低42.59％(P＜0.01)和37.58％(P＜0.01)。
　　4.VPA通過(guò)降低BRCA1和Rad51的表達(dá)抑制HR修復(fù)過(guò)程
　　蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VPA0.5和1 mmol/L處理MC

13、F7細(xì)胞24h后，BRCA1蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比呈降低趨勢(shì);VPA0.5和1 mmol/L預(yù)處理MCF7細(xì)胞24h后再給予8Gy電離輻射處理，Rad51和BRCA1蛋白表達(dá)量與單獨(dú)電離輻射組相比，降低更加明顯。
　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VPA1mmol/L單獨(dú)處理MCF7細(xì)胞24h后，與對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)Rad51焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率（指＞10焦點(diǎn)/細(xì)胞，為4.33％）相比，又降低了2.03％(P＜0.05);VPA0.5和1mmol/

14、L預(yù)處理MCF7細(xì)胞24h再給予8Gy電離輻射后，與單獨(dú)電離輻射組的Rad51焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率(12.55％)相比降低更加明顯，分別降低了6.64％(P＜0.05)和6.59％(P＜0.05)。
　　VPA0.5和1mmol/L單獨(dú)處理MCF7細(xì)胞72h后，與對(duì)照組的細(xì)胞核內(nèi)BRCA1焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率（指＞10焦點(diǎn)/細(xì)胞，為5.13％）相比，分別降低了4.1％(P＜0.05)和3.84％(P＜0.05);VPA預(yù)處理MCF7細(xì)胞24，

15、48和72h后再給予8Gy電離輻射，恢復(fù)6h時(shí)發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)電離輻射組的BRCA1焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率(38.45％)相比，呈時(shí)間依賴(lài)性降低，其中VPA0.5 mmol/L預(yù)處理組分別降低了3.48％(P＞0.05)，23.57％(P＜0.01)和29.22％(P＜0.01);VPA1 mmol/L預(yù)處理組焦點(diǎn)形成陽(yáng)性率變化有相同趨勢(shì)，分別降低了12.71％(P＜0.05)，24.73％(P＜0.01)和30.83％(P＜0.01)。
　　

16、5.安全和臨界劑量VPA對(duì)MCF7細(xì)胞周期的影響
　　VPA0.5和1mmol/L作用于MCF7細(xì)胞后，細(xì)胞周期的各時(shí)相均未發(fā)生顯著性變化。
　　結(jié)論:
　　本課題發(fā)現(xiàn)臨床安全劑量和臨界安全劑量的VPA對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7具有如下作用:
　　1.應(yīng)答DNA損傷反應(yīng)時(shí)，VPA能引起MCF7細(xì)胞核內(nèi)DNA雙鏈斷裂損傷的蓄積。
　　2.VPA不僅對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7生長(zhǎng)具有抑制作用，還能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放射的敏感性。<