TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性與社區(qū)獲得性肺炎易感性及嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　社區(qū)獲得性肺炎（Community acquired pneumonia，CAP）是常見(jiàn)的感染性疾病，一般 CAP患者經(jīng)數(shù)天的抗感染治療即可基本痊愈，然而也有部分患者病情迅速發(fā)展，最后因出現(xiàn)急性肺損傷或感染性休克而死亡。肺炎患者病情差異的原因眾多，基因背景是重要的影響因素之一，不同的基因背景可能影響個(gè)體感染病原菌后的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。炎癥反應(yīng)是機(jī)體清除病原微生物或非己成份的防御反應(yīng)，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)可損傷機(jī)體正常

2、組織細(xì)胞，引起器官功能不全。CAP誘發(fā)急性肺損傷的本質(zhì)是肺局部過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)損傷肺實(shí)質(zhì)與間質(zhì)，肺換氣功能受損繼而出現(xiàn)難以糾正的低氧血癥。炎癥通路分子的過(guò)度活化與炎癥介質(zhì)的不恰當(dāng)釋放是炎癥反應(yīng)過(guò)度激活的原因。炎癥反應(yīng)通路關(guān)鍵分子與炎癥介質(zhì)基因多態(tài)性，可能從遺傳的層面上決定了不同個(gè)體對(duì)感染誘發(fā)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的差異性，最終影響疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后。
　　基因的多態(tài)性現(xiàn)象是在遺傳層面上影響基因表達(dá)的因素?；蚨鄳B(tài)性是指在一個(gè)生物群體中，

3、同時(shí)和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的基因型或等位基因，對(duì)于個(gè)體而言，等位基因的堿基序列終生不變，并按孟德?tīng)栆?guī)律世代相傳。基因多態(tài)性不僅影響遺傳性疾病的發(fā)病率，還可能干預(yù)機(jī)體對(duì)感染性疾病的易感性和預(yù)后，而且基因多態(tài)性是基因的固有特征，不受機(jī)體的生理狀態(tài)與壽命影響。因此對(duì)CAP患者穩(wěn)定的基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)可以對(duì)CAP嚴(yán)重程度及預(yù)后進(jìn)行判斷，并以此作為制訂和調(diào)整治療方案的依據(jù)。
　　活化炎癥反應(yīng)的信號(hào)分子眾多，腫瘤壞死因子α(Tumor N

4、ecrosis Factor alpha，TNF-α)、腫瘤壞死因子受體（Tumor Necrosis Factor Receptor，TNFR）及核因子kappa B（Nuclear factor kappa B，NF-κB）是炎癥反應(yīng)激活和放大過(guò)程的關(guān)鍵分子，在感染所引發(fā)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。機(jī)體在致炎因素的作用下通過(guò)炎癥反應(yīng)通路引起初次的TNF-α釋放，此釋放后的TNF-α與炎癥細(xì)胞表面的TNFR結(jié)合，向下激活NF-κB，由NF

5、-κB調(diào)節(jié)其他炎癥介質(zhì)的表達(dá)，如IL-6、IL-1β等，提高了炎癥反應(yīng)強(qiáng)度；NF-κB也促進(jìn)TNF-α的釋放，此部分TNF-α再次與TNFR結(jié)合，再次活化炎癥反應(yīng)通路，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大作用，形成正反饋放大炎癥反應(yīng)。NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其非編碼區(qū)內(nèi)若干核苷酸的插入或缺失影響NF-κB對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)活性。TNF-α與 TNFR結(jié)合能放大炎癥反應(yīng)和介導(dǎo)細(xì)胞死亡，二者的基因啟動(dòng)子存在的多態(tài)性位點(diǎn)可能影響二者的表達(dá)量，從而影

6、響炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。
　　鑒于TNF-α、TNFR及NF-κB在重癥肺炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，且國(guó)內(nèi)外尚少見(jiàn)TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性與 CAP易感性及嚴(yán)重程度相關(guān)性的報(bào)道，通過(guò)研究 TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性，預(yù)測(cè)機(jī)體對(duì)CAP易感性、嚴(yán)重程度及預(yù)后有重大意義。
　　本實(shí)驗(yàn)采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction

7、fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、采用聚合酶鏈反應(yīng)-高分辨率熔解曲線(xiàn)法(polymerase chain reaction-high resolution melting curve，PCR-HRM)及基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)中國(guó)廣東漢族人群社區(qū)獲得性肺炎患者及健康人群的TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性分布情況，分析其基因多態(tài)性與肺炎易感性、嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為以期通過(guò)炎癥反應(yīng)通路關(guān)鍵分子的

8、基因多態(tài)性分析進(jìn)行 CAP易感性、嚴(yán)重程度及預(yù)后預(yù)測(cè)，指導(dǎo)臨床治療。
　　材料與方法：
　　1、研究對(duì)象 CAP組為2010年10月-2011年6月就診于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院的肺炎患者66例，其中男性37例，女性29例，年齡18-83歲，平均年齡（60.59±14.67）歲；對(duì)照組為廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院的健康體檢人群66例，其中男性31例，女性35例，年齡21-83歲，平均年齡(54.62±15.45)歲。兩組人群均為無(wú)血緣關(guān)系

9、的廣東地區(qū)漢族人，且在性別、年齡上分布沒(méi)有差異。根據(jù)2007年 IDSA/ATS關(guān)于成人 CAP的診治指南，將 CAP患者分為重癥肺炎組(severe community-acquired pneumonia,SCAP）和非重癥肺炎組（non-SCAP,NSCAP），根據(jù) CURB-65和PSI評(píng)分量化肺炎嚴(yán)重程度。根據(jù)患者28天內(nèi)是否存活，分為死亡組和存活組。
　　2、基因組DNA提取及定量各研究對(duì)象抽取1mLEDTA抗凝的外周

10、靜脈血，使用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，通過(guò)Nanodrop2000對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行濃度和純度分析。根據(jù)測(cè)定結(jié)果將樣本DNA稀釋至30ng/μL的工作液。
　　3、對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用PCR-RFLP、PCR-HRM及基因測(cè)序檢測(cè) TNF-α、TNFR及 NF-κB的基因多態(tài)性，并抽樣測(cè)序驗(yàn)證多態(tài)性結(jié)果準(zhǔn)確性。TNF-α-308G/A、TNFR1-609G/T、TNFR1+36A/G、TNFR2+676

11、T/G的基因多態(tài)性使用PCR-RFLP進(jìn)行檢測(cè)； TNFR2+1663A/G、+1668 T/G、+1690 C/T使用測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)。NFκB1-94ins/del ATTG采用PCR-HRM進(jìn)行檢測(cè)。
　　4、統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，如理論頻數(shù)<5，采用Fisher確切概率法。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，非正態(tài)資料以中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示。計(jì)量資料組間比較采

12、用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α取0.05。
　　結(jié)果：
　　1、TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性分布情況
　　在CAP組和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)攜帶TNFR1+36GG、TNFR2+1668GG基因型的人群。TNF-α-308G/A、TNFR1+36A/G、TNFR2+676T/G、TNFR2+1663A/G、+1668 T/G、+1690C/T及NFκB1-94ins/delATTG的基因型及等位基因在CAP組和

13、對(duì)照組之間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），TNFR1-609G/T基因型在CAP組和Control組之間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；其等位基因分布在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.036）。
　　2、TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性與肺炎嚴(yán)重程度的相關(guān)性
　　TNF-α-308G/A、TNFR1+36A/G、TNFR2+676T/G及 NFκB1-94ins/delATTG的基因型及等位基因在S

14、CAP組和NSCAP組之間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），TNFR1-609G/T、TNFR2+1690C/T的基因型在SCAP組和NSCAP組之間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），TNFR1-609G/T、TNFR2+1690C/T的等位基因在SCAP組和NSCAP組之間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027）。
　　TNF-α-308G/A、TNFR1-609G/T、TNFR1+36A/G、TNFR2+676T/G、T

15、NFR2+1663 A/G、+1668 T/G、+1690C/T及NFκB1-94ins/delATTG多態(tài)性在死亡組和存活組之間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　根據(jù)TNF-α-308G/A、TNFR1-609G/T、TNFR1+36A/G、TNFR2+676T/G、TNFR2+1663A/G、+1668 T/G、+1690C/T及NFκB1-94ins/delATTG的多態(tài)性分類(lèi)，肺炎患者各組間的住院時(shí)間、白細(xì)胞數(shù)、

16、中性粒細(xì)胞數(shù)、血沉、C-反應(yīng)蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　根據(jù) TNF-α-308G/A、TNFR1+36A/G、TNFR1-609G/T、TNFR2+676T/G、TNFR2+1663A/G、+1668 T/G、+1690C/T及NFκB1-94ins/delATTG的多態(tài)性分類(lèi)，肺炎患者各組間的CURB-65、PSI評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. TNFR2+1668G等