hPPARα配體的HPLC-UV法篩選平臺的建立.pdf

1、目的:建立人過氧化物酶體增殖物活化受體alpha（human peroxisome prolifterator-activated receptors alpha，hPPARα）配體的HPLC-UV法篩選平臺。 方法:含重組質(zhì)粒的宿主菌（pMAL-p2X-hPPARs/TB1）經(jīng)最佳優(yōu)化條件誘導(dǎo)后，超聲破碎取上清，產(chǎn)物用多糖親和樹脂進行純化獲MBP-hPPARsLBD，再用Xa因子酶切、多糖親和樹脂層析和DEAE-52陰離子交換

2、層析純化回收hPPARsLBD。采用HiTrap desalting（SephadexG-25，1.6×2.5cm）色譜柱，柱溫8℃，以PBS為流動相，進樣量為20μL，洗脫速度為1.0 mL/min。以檢測苯扎貝特（Bez）進行方法學(xué)考察。然后取40μg hPPARα LBD或80μg MBP-hPPARα LBD，以Bez為陽性配體，AA為競爭性冷藥，反應(yīng)達平衡后取100μ L進樣，進行結(jié)合反應(yīng)條件的優(yōu)化。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，取不同

3、濃度的Bez（陽性藥）和羅格列酮（Ros）（陰性藥）進行結(jié)合實驗，計算特異性結(jié)合（SB）。根據(jù)實驗結(jié)果確立HPLC-UV法篩選hPPARs配體的判斷標(biāo)準(zhǔn)。最后以hPPARα的選擇性激動劑非諾貝特（Fen）和Bez、hPPARγ的選擇性激動劑Ros和吡格列酮（Pio）為待試藥，檢驗所建立的HPLC-UV法hPPARs配體篩選平臺的有效性。 結(jié)果:含重組質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)最佳優(yōu)化條件誘導(dǎo)，從1L培養(yǎng)物中可獲得約20 mg MBP-hPP

4、ARsLBD。經(jīng)純化以及酶切回收，獲得了電泳純的MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD，其產(chǎn)量分別為14 mg/L和5mg/L。色譜圖中PPARs的保留時間為1.6 min，而Bez的保留時間為6.3min。分離效果較好，柱效高，峰形對稱。Bez在0.5-200μ mol/L（3.6-1447 ng）范圍內(nèi)線性良好，LOD為0.2μ mol/L，，日內(nèi)、日間RSD均小于5％。MBP-hPPARαLBD和hPPARαLBD同Bez

5、的結(jié)合按照最佳優(yōu)化條件（25℃孵育40 min pH值分別以8.4和8.00，）反應(yīng)，SB/TB值均超過了65％。根據(jù)分子排阻色譜分離（Molecular Exclusion Chromatography，MEC）理論，取不同濃度的Bez（陽性藥）和Ros（陰性藥）進行結(jié)合實驗，確定SB同藥物濃度存在量-效關(guān)系作為hPPARs配體的判斷標(biāo)準(zhǔn)，建立了HPLC-UV法hPPARα配體篩選平臺。經(jīng)檢驗，該平臺能從待試藥中有效地篩查出hPPAR