通過血腦屏障的短肽藥物載體平臺技術(shù)的建立和短肽結(jié)合蛋白的篩選.pdf

1、本論文通過設(shè)計和構(gòu)建短肽-HSA融合蛋白表達(dá)載體,表達(dá)純化融合蛋白,體外細(xì)胞學(xué)及動物體內(nèi)實驗,建立了一個驗證模擬多肽作為載體轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)通過血腦屏障的技術(shù)平臺,為今后大規(guī)模的篩選驗證打下基礎(chǔ).同時,我們還對短肽能夠在血管內(nèi)皮細(xì)胞上定位的機制進(jìn)行了初步研究,希望發(fā)現(xiàn)腦部血管內(nèi)皮細(xì)胞上新的與血腦屏障有關(guān)的標(biāo)志分子.首先,酵母分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建.設(shè)計和構(gòu)建了帶有短肽基因插入位點的融合基因序列EcoRI-Kozak-α-factor-(EagI

2、)(XhoI)-HSA-EcoRI,將融合基因用EcoRI酶切后克隆至pAO815的EcoRI位點,得到pAO-HSA.人工合成兩個短肽基因,在兩端加上EagI和XhoI酶切位點,雙酶切后插入pAO-HSA質(zhì)粒中,得到pAO-7/12-HSA.隨后,利用畢赤酵母表達(dá)體系完成了重組蛋白的表達(dá)、純化,并得出了重組蛋白穩(wěn)定表達(dá)以及大量純化的條件.三種重組蛋白的表達(dá)量都在10 mg/L左右,能夠穩(wěn)定表達(dá),經(jīng)過疏水柱層析和Sephadex G-1

3、00凝膠過濾層析兩步純化后均可得到純度高于85%的產(chǎn)物.然后,體外培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞,通過免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測短肽-HSA融合蛋白進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力.結(jié)果顯示三種重組蛋白均能夠進(jìn)入細(xì)胞,而且進(jìn)入的量相差不多.這說明該細(xì)胞能夠主動攝取rHSA,很可能細(xì)胞表面表達(dá)有HSA受體.今后的篩選中以采用腦部血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實驗較好.最后,動物體內(nèi)實驗對短肽-HSA融合蛋白能否通過血腦屏障進(jìn)行了驗證.將重組蛋白通過尾靜脈注射小鼠,4

4、hr后麻醉小鼠,取出腦組織進(jìn)行免疫組化檢測.結(jié)果顯示,與未注射蛋白的陰性對照組相比,注射了rHSA,7-rHSA,和12-rHSA的小鼠腦組織未見到明顯差異,在小血管內(nèi)皮細(xì)胞上沒有見到著色,腦實質(zhì)也沒有明顯著色.今后的實驗中將在已建立的技術(shù)平臺上進(jìn)行大規(guī)模的驗證,以期能夠篩選到理想的載體.同時,我們還利用酵母雙雜交篩選腦cDNA文庫,篩選能夠與環(huán)7肽結(jié)合的蛋白編碼順序,對環(huán)7肽能夠在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上定位的機制進(jìn)行了初步探討.結(jié)果顯示,電