2-DE結(jié)合多維色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析阿替洛爾對(duì)映異構(gòu)體作用于血管平滑肌細(xì)胞時(shí)的差異表達(dá)蛋白.pdf

1、目的：β-受體阻滯劑（Beta-blockers）是一系列具有手性特征的藥物，其中阿替洛爾（Atenolol，AT）為選擇性β1受體阻滯劑，臨床用于治療高血壓、心絞痛及心律失常，也用于治療青光眼。阿替洛爾化學(xué)名為2-[4-[2-Hydroxy-3-（isopropylamino）propoxy]phenyl]acetamide，因其分子中有一個(gè)手性中心，存在著一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體（enantiomers），目前臨床上使用的制劑均以S和R對(duì)映體

2、各半混合的外消旋體（racemate）形式給藥。但是，這兩種對(duì)映體不僅在藥理作用的類型、強(qiáng)度而且在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝等方面都存在顯著差異，其S型的心臟β阻斷活性是R型的46倍。近年來(lái)，有關(guān)阿替洛爾在臨床治療中的副作用多有報(bào)道，并由此引起了關(guān)于β受體阻滯劑是否應(yīng)該從一線藥物中撤除的熱烈討論。因此，研究阿替洛爾兩種光學(xué)異構(gòu)體的分子作用機(jī)制的差別有著重要的理論和實(shí)際意義。 蛋白質(zhì)組學(xué)與藥學(xué)的學(xué)科交叉逐漸形成新的研究領(lǐng)域-藥物蛋

3、白質(zhì)組學(xué)。其研究?jī)?nèi)容在臨床前包括：發(fā)現(xiàn)所有可能的藥物作用靶點(diǎn)，以及針對(duì)這些靶點(diǎn)的全部可能的化合物。也包括應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究藥物作用機(jī)制和毒理學(xué)；在臨床研究方面包括：藥物作用的特異蛋白作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標(biāo)志物，也可應(yīng)用類似于藥物遺傳學(xué)的方法，按照蛋白質(zhì)譜來(lái)分類患者，給予個(gè)體化治療，并預(yù)測(cè)藥物療效。二維凝膠電泳和質(zhì)譜的結(jié)合與精致的生物信息學(xué)建立了一套強(qiáng)有力的、通用的方法，為藥物蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了技術(shù)支持。

4、本文以阿替洛爾（R），（S）對(duì)映異構(gòu)體作用于血管平滑肌細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，以雙向電泳技術(shù)初步分離蛋白質(zhì)，再對(duì)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行酶解，通過(guò)HPLC-CHIP富集、分離酶解肽混合物，線性離子阱質(zhì)譜途徑在線鑒定差異蛋白，以求對(duì)阿替洛爾對(duì)映異構(gòu)體與靶蛋白間的相互作用和β-受體阻滯劑類手性藥物作用機(jī)制有更深入的了解，從而為手性藥物的開發(fā)提供全新的研究策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：蛋白樣品的制備：將VSMC在DMEM培養(yǎng)液中，含胎牛血清（

5、FBS）10％、37℃、5％CO2、濕度為90％的環(huán)境中培養(yǎng)。達(dá)到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)改用含有阿替洛爾和阿替洛爾的培養(yǎng)液中培養(yǎng)液培養(yǎng)。運(yùn)用MTT法測(cè)定藥物細(xì)胞毒性，以確定作用藥物濃度。接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞于96孔板，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用不含有血清分別含消旋的阿替洛爾0、0.15、1.5、15、30、60、120、μmol/L的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞4小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，用5mg/mLMTT的PBS溶液作用4小時(shí)后吸出所有溶液用100μLDMSO溶解

6、，590nm掃描酶標(biāo)儀測(cè)定數(shù)據(jù)。 雙向電泳：分別用120μmol/L的R-阿替洛爾和S-阿替洛爾處理細(xì)胞4小時(shí)后，用刮取法收集細(xì)胞，按照用水化上樣緩沖液Ⅱ提取細(xì)胞全蛋白，-80℃保存各蛋白樣品。均用固相pH膠條（17cm，pH3～10）進(jìn)行分析。200μg蛋白樣品在重泡脹液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，30mmol/LDTT，0.5％IPG緩沖液，痕量溴酚藍(lán)）中重懸，被動(dòng)水化過(guò)夜（12～16h）。之后進(jìn)行

7、雙向電泳（一向：IEF；二向：12％SDS-PAGE電泳），根據(jù)Bio-Rad雙向電泳實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。2-DE的分離結(jié)果用經(jīng)典質(zhì)譜兼容銀染法染色后進(jìn)行圖像掃描，以PDQest7.4.0圖像分析軟件分析凝膠并尋找差異點(diǎn)。根據(jù)差異分析結(jié)果，兩種樣品中的同一種蛋白質(zhì)如存在1.5倍以上的光密度差異，則視為具有表達(dá)量的差異。 HPLC-CHIP/MS分析：富集柱等度洗脫條件：流動(dòng)相為0.1％（v/v）甲酸-超純水溶液，流速：4μL/min；

8、分離柱梯度洗脫條件：流動(dòng)相A為0.1％（v/v）甲酸-超純水溶液，流動(dòng)相B為0.1％（v/v）甲酸-乙腈溶液，起始流動(dòng)相為3％（v/v）B，保持2min，17min時(shí)流動(dòng)相B為55％（v/v），20min時(shí)B為75％（v/v），保持5min，流速：0.3μL/min。UltraXCTiontrapMassSpectrometer以CHIPcube作為離子源，毛細(xì)管電壓2000V，干燥氣流速0.32L/min，干燥氣溫度325℃，質(zhì)量掃描

9、范圍m/z：300～1500Da。 SpectrumMillMSProteomicsWorkbench（RevA.03.03.078）自動(dòng)分析MS和MS/MS數(shù)據(jù)，搜索UniProtKB/SWISS-PORT，HomoSapiens（Human）數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索參數(shù)設(shè)置：Trypsin（胰蛋白酶），MonoisotopicMassvalues（單同位素質(zhì)量），Peptidetol.（母離子質(zhì)量允差）±2.5Da，MS/MSto

10、l.（MS/MS質(zhì)量允差）±0.7Da，Carbamidometholation（C）修飾。搜索后自動(dòng)以下列條件進(jìn)行有效性驗(yàn)證：蛋白評(píng)分大于11.0；肽評(píng)分大于6.0；SPI（Structurepredictabilityindexforproteinsequences）大于60％。 結(jié)果：通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)，確定在120μmol/L下選擇實(shí)驗(yàn)濃度都是可行的，最終實(shí)驗(yàn)以120μmol/L為阿替洛爾的濃度。通過(guò)優(yōu)化條件，最終確定合適的

11、樣品上樣量為200μg、染色方法為銀染通過(guò)對(duì)R-ATE和S-ATE作用動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后的二維凝膠電泳圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)約有6個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)有差異，對(duì)6個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行LC-CHIP-MS/MS分析后，鑒定出了6種可能的差異表達(dá)蛋白。 結(jié)論：本文建立了新的分析阿替洛爾（R），（S）對(duì)映異構(gòu)體作用于VSMC的差異蛋白的雙向電泳和多維色譜串聯(lián)質(zhì)譜策略。鑒定出的6種差異表達(dá)蛋白可能在R-AT與S-AT手性生物學(xué)特征的發(fā)生機(jī)制中起有重要