普萘洛爾對映異構體的立體選擇性分析與GBLP功能研究.pdf

1、目的 通過普萘洛爾(Propranolol，Pro)對映異構體(R-Pro、S-Pro)在Caco-2細胞單層模型上的吸收轉運研究，R-Pro、S-Pro誘導Caco-2、HepG-2和HUVEC細胞后的差異表達蛋白質的比較研究，以及對GBLP進行的功能研究，在蛋白質水平進一步闡明普萘洛爾手性選擇性的生物學特征，為探討β1β2受體阻斷劑對映異構體立體選擇性的作用機制提供新的實驗依據。 策略與方法 1.Caco-2

2、細胞單層模型的建立：將Caco-2細胞接種于Transwell的聚碳酸脂膜上，培養(yǎng)到21～25天時，通過測定跨膜電阻(TEER法)、表觀滲透系數(熒光黃測定法)和形態(tài)學觀察(掃描電鏡和透射電鏡)對細胞單層的完整性和穩(wěn)定性進行評估。 2.R-Pro和S-Pro吸收轉運實驗：用R-Pro和S-Pro分別處理Caco-2細胞單層，運用高效液相色譜法測定細胞單層膜兩側的藥物濃度，評價其吸收轉運方式。 3.運用比較蛋白質組分析R-

3、Pro、S-Pro分別作用于Caco-2、HepG-2和HUVEC細胞后的差異表達蛋白譜。提取兩種對映異構體作用于三種細胞后全細胞蛋白質，對三組細胞蛋白質進行雙向電泳分離。通過優(yōu)化各種條件參數來確定合適的上樣量和染色方法。用PDQuet(7.4.0)軟件對掃描的二維凝膠電泳圖譜時行分析，篩選出各組細胞中的差異表達蛋白斑點。候選差異蛋白斑點經膠內胰酶酶解后進行MALDI-TOF-MS分析，對得到的肽質量指紋圖譜(peptide massf

4、ingerprinting,PMF)使用Mascot軟件在SwissProt數據庫中檢索鑒定差異表達蛋白質。 4.對篩選出的差異表達蛋白GBLP用Western blot法和激光共聚焦檢測GBLP在R-Pro、S-Pro誘導HUVEC細胞后的表達情況及細胞內定位。 5.GBLP相互作用蛋白質的篩選：提取R-Pro和S-Pro作用HUVEC后的細胞與對照細胞中的蛋白質，用免疫沉淀方法分離與GBLP可以存在相互作用的蛋白質；用LC-

5、ESI-MS/MS技術對分離得到的蛋白質進行鑒定。 結果 1.本課題建立的Caco-2細胞單層模型，形態(tài)學檢查可觀察到細胞融合成連續(xù)而完整的單細胞層，細胞間連接緊密，細胞表面覆蓋一層刷狀緣微絨毛，垂直于細胞表面，并且細胞具有不對稱性，這些形態(tài)與小腸上皮細胞相似；培養(yǎng)21天后測得的細胞單層的熒光黃通透系數Papp(1.0×10 -6cm/s，跨膜電阻TEER)200(Ω*cm2)，說明細胞單層完整性好；建立好的Caco-2

6、細胞單層模型在Hank平衡鹽溶液(HBSS)中培養(yǎng)8h內，Papp值小于1.0×10 -6(cm/s)，TEER值大于200(Ω*cm2)，說明細胞單層模型穩(wěn)定性好。 2.累積2h普萘洛爾對映異構體的表觀通透系數的結果顯示，在20-240μmol/L的濃度范圍內測得的Papp值，無論對于R-Pro，還是S-Pro，Papp值變化微小，均無顯著性差異。 3.通過優(yōu)化條件，最終確定合適的樣品上樣量為100μg、染色方法為銀染。通過分

7、別對R-Pro和S-Pro作用Caco-2、HepG-2和HUVEC后的二維凝膠電泳圖譜進行分析，分別發(fā)現(xiàn)約有25個、30個和36個蛋白斑點表達有差異，對其中25個、15個和18個差異蛋白斑點進行MALDI-TOF-MS分析后，分別鑒定出了8種、4種和10種可能的差異表達蛋白。 4.激光共聚焦及Western blot檢測結果均表明：GBLP在S-Pro作用后的HUVEC細胞中表達明顯低于R-Pro作用后。GBLP定位于細胞質膜

8、與胞漿中。 5.用免疫共沉淀方法在R-Pro和S-Pro作用HUVEC實驗組與對照組細胞中都共分離到了8條蛋白條帶；質譜鑒定出了這些條帶中的9個蛋白，其中7個蛋白可能為GBLP相互作用蛋白，分別為： Caseinalpha-S1、Casein alpha-S1、Beta casein、Desmoglein 1 precursor、Alphaenolase、Peroxiredoxin 2與Fructose-bisphosphate

9、 aldolase C結論1.普萘洛爾屬于高通量藥物，主要為被動吸收，R-Pro與S-Pro兩個對映異構體在吸收轉運方面不存在立體選擇性。 2.鑒定出的差異表達蛋白可能在R-Pro與S-Pro手性生物學特征的發(fā)生機制中起有重要作用。 3.GBLP在R-Pro與S-Pro處理HUVEC細胞后的表達存在明顯差異，根據生物信息學搜索結果，推測：(1)GBLP可能參與了R-Pro與S-Pro手性生物學效應的信號轉導通路；(2)G