大承氣湯對大鼠失血性休克再灌注肝組織iNOS表達的影響.pdf

1、失血性休克是臨床上常見的危重癥之一，休克時全身各組織器官處于低灌流狀態(tài)。能被成功搶救的患者經(jīng)過液體復(fù)蘇等一系列治療后，可使灌流量明顯恢復(fù)，但隨之而來的再灌注損傷卻使得組織細胞的損傷進一步加重，并引起細胞死亡或進一步功能障礙。缺血再灌注損傷是失血性休克復(fù)蘇救治過程中重要的病理生理變化，也是失血性休克后期并發(fā)癥和多器官功能衰竭的重要原因之一。因此對于再灌注損傷的病理生理機制研究是防治再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)，也一直是我們關(guān)注的焦點。
　　

2、 一氧化氮( nitric oxide，NO)是迄今為止在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個氣體性細胞內(nèi)及細胞間信息分子，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，NO的大量釋放在氧化應(yīng)激、影響線粒體和能量代謝、作用于酶蛋白、胞液Ca2+上調(diào)等多個方面參與了肝臟缺血再灌注損傷的病理生理過程，證實NO介導(dǎo)了肝臟的缺血再灌注損傷。而NO在缺血期和再灌注期的過度釋放主要是受誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的調(diào)控，故組織細胞iNOS的廣泛表達是NO大量生成并導(dǎo)致細胞損害的基礎(chǔ)和決定因素

3、。
　　 對于肝臟缺血再灌注損傷臨床上尚缺乏有效的治療手段。近年來，中藥預(yù)處理因為其安全范圍大、毒副作用小、作用環(huán)節(jié)較多等優(yōu)點，逐漸成為研究的熱點之一。大承氣湯是《傷寒論》中的著名方劑之一，臨床上應(yīng)用以大承氣湯方劑為代表的的通里攻下法治療普外科感染性急腹癥及并發(fā)癥，已取得了確定而顯著的療效。特別是在消化外科危重癥和多器官功能不全綜合癥(MODS)中，大承氣湯的應(yīng)用研究較為深入和突出。其臟器保護作用研究涉及胃、腸、肺、肝、胰腺、腎

4、臟等多個器官。現(xiàn)代藥理研究也表明，大承氣湯有促進胃腸運動、抗菌、調(diào)節(jié)細胞因子、抗自由基、拮抗脂氧化物、增強免疫、保護組織器官等多種作用。實驗研究證明，大承氣湯通過抑制腸源性內(nèi)毒素血癥，降低肝細胞溶酶體膜的溶破率，抑制過度炎性反應(yīng)狀態(tài)等，而在缺血再灌注損傷的病理生理過程中，起到了保護肝臟功能的作用。
　　 目前的研究認為NO的大量生成是肝臟缺血再灌注損傷的前提和基礎(chǔ)，大承氣湯是否能夠通過下調(diào)iNOS的表達，從而抑制NO的大量生成，

5、達到保護肝臟功能的作用，目前尚未見這方面的報道。
　　 研究目的：本實驗通過觀察失血性休克再灌注大鼠肝組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達與分布，探討中藥大承氣湯對失血性休克大鼠肝組織損傷的防治作用及其可能機制，為防治肝臟缺血再灌注損傷提供新的思路與方法。
　　 研究方法：大承氣湯由大黃酒洗12g、厚樸去皮炙15g、枳實15g、芒硝9g組成，按《中華人民共和國藥典》規(guī)格采購。制劑方法：大黃酒洗12g、厚樸去皮炙15g

6、、枳實15g、芒硝9g(共計51g)，以上藥物加水100ml煎至25.5ml即為含生藥2.0g/ml，大鼠按2.0g/100g體重給藥，藥液4℃條件下保存三天，給藥前復(fù)溫至室溫25℃。
　　 造模成功的SD大鼠24只，雌雄各半，體重180～200克。隨機分為以下三組(每組8只)，各組大鼠體重與性別比例無統(tǒng)計學差異。
　　 手術(shù)對照組：按照失血性休克模型的建立步驟進行手術(shù)，但不放血，從而大鼠不經(jīng)過休克過程?？瞻讓φ战M：實驗

7、前連續(xù)2天生理鹽水1ml/100g體重灌胃，每日2次，之后建立失血性休克及復(fù)蘇模型。大承氣湯組；實驗前連續(xù)2天大承氣湯(含生藥2.0g/ml)1ml/100g體重灌胃，每日2次，之后建立失血性休克及復(fù)蘇模型。各組動物術(shù)前禁食24h。
　　 建立重度失血性休克及復(fù)蘇動物模型，通過頸總動脈放血并回輸?shù)却胧┦寡獕壕S持在5.3kPa(40mmHg)持續(xù)90min，之后快速從靜脈輸回原血并補充和失血量等量的生理鹽水(5min內(nèi)完成)進行搶

8、救，復(fù)蘇后90min取肝臟標本，石蠟包埋、切片。每個標本制作6個切片，其中1個切片進行光鏡下病理觀察，其余的進行iNOS表達與分布的分析，5個切片中，2個進行iNOS陽性表達程度的觀察，3個采用ImageJ軟件測定陽性細胞平均灰度值。
　　 石蠟切片進行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組動物肝組織病理變化即肝細胞損傷情況；應(yīng)用iNOS特異性抗體免疫組化定性及半定量檢測肝細胞iNOS的表達與分布，切片中出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽性細胞。切

9、片內(nèi)無陽性細胞為表達陰性(-)，陽性細胞率小于1/3為表達弱陽性(+)，1/3～2/3為表達陽性(++)，大于2/3為表達強陽性(+++)。應(yīng)用ImageJ軟件對免疫組化顯色結(jié)果進行拍照、灰度分析。實驗所得數(shù)據(jù)計量資料用均數(shù)士標準差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件，分別使用方差分析、X2檢驗和t檢驗對相應(yīng)的資料進行統(tǒng)計學分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.肝組織病理變化：
　　

10、 光鏡下可見手術(shù)對照組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉、匯管區(qū)清晰，肝細胞結(jié)構(gòu)正常；空白對照組肝細胞及肝竇內(nèi)皮細胞水腫肝細胞索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞灶性壞死伴大量中性粒細胞聚集、浸潤，肝竇狹窄甚至閉塞；大承氣湯組肝組織基本保持了正常的結(jié)構(gòu)，肝小葉、匯管區(qū)清晰，少量炎性細胞浸潤，肝細胞水腫程度明顯輕于模型組，肝竇仍然保持通暢。
　　 2.免疫組化：
　　 結(jié)果顯示，①手術(shù)對照組大鼠肝組織中iNOS基本不表達；②肝缺血再灌注時(空白對照組)

11、iNOS有較大面積表達；③手術(shù)對照組和空白對照組iNOS表達程度光鏡觀察組間比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；④大承氣湯組iNOS陽性細胞數(shù)目明顯減少；⑤大承氣湯組和空白對照組iNOS表達程度光鏡觀察組間比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；⑥空白對照組和大承氣湯組陽性顆粒主要位于肝細胞胞漿內(nèi)及胞膜，炎性細胞也可見部分表達；⑦手術(shù)對照組和大承氣湯組iNOS表達程度光鏡觀察組間比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；⑨手術(shù)對照組和空白對照組iNOS

12、陽性細胞平均灰度值比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；⑨大承氣湯組和空白對照組iNOS陽性細胞平均灰度值比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；⑩手術(shù)對照組和大承氣湯組iNOS陽性細胞平均灰度值比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.大承氣湯能明顯減輕大鼠失血性休克再灌注肝組織的細胞損害，但尚不能完全逆轉(zhuǎn)；
　　 2.失血性休克再灌注后，肝組織iNOS表達明顯上調(diào)；
　　 3.大承氣湯能下調(diào)肝