牛磺酸拮抗膽紅素聽覺中樞毒性機制的實驗研究.pdf

1、第一部分明確SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核GABAergic效應逆轉(zhuǎn)時間
　　目的:聽覺障礙是新生兒膽紅素腦病的臨床表現(xiàn)之一，但是具體機制不明。興奮毒性是膽紅素腦病導致新生兒聽覺損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往研究顯示，GABA受體是中樞最主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體，大部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元在發(fā)育過程中都會經(jīng)歷GABA能（GABAergic）效應由去極化向超極化的轉(zhuǎn)變。膽紅素會顯著增加未成熟聽覺核團的GABAergic突觸傳遞。我們猜測，膽紅素可能通過

2、增加去極化的GABAergic效應對未成熟神經(jīng)元產(chǎn)生興奮毒性。但是，腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元GABAergic效應的逆轉(zhuǎn)時間目前仍然不明。本研究旨在明確SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元GABAergic效應的逆轉(zhuǎn)時間及該核團內(nèi)不同類型神經(jīng)元GABAergic效應逆轉(zhuǎn)的時間之間是否有差異，該項研究對于了解膽紅素興奮毒性對腹前側(cè)耳蝸核不同類型神經(jīng)元的作用時間及方式具有重要意義。
　　方法:急性單離出生后5到15天(postnatalday5-15

3、，P5-15)的SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核，將神經(jīng)元分為P5-7、P9-11、P13-15三組。聯(lián)合形態(tài)學和膜片鉗電生理的方法區(qū)分SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核的bushy細胞和stellate細胞。在穿孔膜片鉗的電流鉗模式下，給予細胞膜0pA的電流刺激，記錄每個神經(jīng)元的靜息電位。在穿孔膜片鉗的電壓鉗模式下，將細胞膜電位分別鉗制在-80mV、-60mV、-40mV、-20mV、0mV，記錄GABA(100μM)誘發(fā)電流，根據(jù)GABA誘發(fā)電流的幅度和與其

4、對應的鉗制電壓大小，繪制電流-電壓曲線，再利用Nemst公式計算GABA平衡電位，由GABA平衡電位和靜息電位之間的差值判斷此時GABAergic效應是去極化還是超極化，如果GABA平衡電位小于細胞靜息電位，此時GABAergic效應引起細胞產(chǎn)生去極化，細胞的興奮性增加;如果GABA平衡電位大于細胞靜息電位，此時GABAergic效應引起細胞產(chǎn)生超極化，細胞的興奮性降低。然后明確不同類型神經(jīng)元（bushy細胞、stellate細胞）GA

5、BAergic效應逆轉(zhuǎn)的具體時間有無差異及其產(chǎn)生機制。
　　結(jié)果:在bushy細胞中，GABAergic效應由興奮性逆轉(zhuǎn)為抑制性的百分比分別為:67％（P5-7組）、97％（P9-11組）和100％（P13-15組）。在stellate細胞中，GABAergic效應由興奮性逆轉(zhuǎn)為抑制性的百分比分別為:21％（P5-7組）、35％（P9-11組）和91％（P13-15組）。比較bushy細胞和stellate細胞靜息電位之間的差異，

6、發(fā)現(xiàn)兩種細胞靜息電位均值在P5-7組分別為-54.6±5.6mV和-60.6±3.7mV，在P9-11組為-56.7±3.7mV和-62.3±5.0mV，bushy細胞靜息電位的數(shù)值均大于stellate細胞;然而在P13-15組兩種細胞的靜息電位數(shù)值無差異，分別為-61.7±3.2mV和-63.0±3.3mV。兩種細胞的GABA平衡電位在P5-7組、P9-11組、P13-15組均無差異（分別為P5-7組:-58.3±8.8mVVS.-

7、54.4±11.2mV、P9-11組:-62.8±5.5mVVS.-61.0±8.1mV、P13-15組:-70.4±7.2VS.-72.0±8.1mV)。根據(jù)GABA平衡電位和靜息電位之間的差值，發(fā)現(xiàn)GABAergic效應在絕大部分的bushy細胞為超極化發(fā)生在P7，而其在絕大部分的stellate細胞為超極化發(fā)生在P13。
　　結(jié)論:SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核的bushy細胞和stellate細胞GABAergic效應逆轉(zhuǎn)時間點不同

8、，GABAergic效應在bushy細胞由去極化轉(zhuǎn)變?yōu)槌瑯O化的時間發(fā)生在出生后第一周末，而GABAergic效應在stellate細胞由去極化轉(zhuǎn)變?yōu)槌瑯O化的時間發(fā)生在出生后第二周末。不同類型細胞之間靜息電位在發(fā)育過程中的差異可能是bushy細胞和stellate細胞GABAergic效應在不同時間點逆轉(zhuǎn)的原因。更持久的去極化GABAergic效應可能導致stellate細胞比bushy細胞更容易在發(fā)育過程中受到膽紅素的毒性損害。

9、　　第二部分?；撬嵩赟D大鼠腹前側(cè)耳蝸核激活GABAA-R和glycine-R的實驗研究
　　目的:?；撬嵬ㄟ^激活抑制性GABAA-R和/或glycine-R起到抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的作用，不同濃度?；撬嵩诓煌藞F激活GABAA-R、glycine-R的類型也不盡相同。由于興奮毒性是膽紅素聽覺中樞神經(jīng)毒性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，我們猜想牛磺酸可能通過激活抑制性GABAA-R和/或glycme-R產(chǎn)生抑制效應，降低細胞興奮性，從而拮抗膽紅素興奮毒性。

10、但是，目前仍缺乏?；撬嵩赟D大鼠腹前側(cè)耳蝸核對以上兩種受體激活作用的相關(guān)研究。該項研究不但為其他關(guān)于?；撬崤c腹前側(cè)耳蝸核表面抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體相互作用的研究提供了電生理依據(jù)，還為將牛磺酸作為一種有效的治療新生兒膽紅素腦病的藥物提供了理論上的可行性。
　　方法:急性單離出生后13-15天的SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元，采用全細胞膜片鉗記錄技術(shù)，觀察?；撬崤cSD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元（bushy細胞、stellate細胞）GABAA-R

11、、glycine-R的相互作用，以及不同濃度?；撬峒せ钜种菩陨窠?jīng)遞質(zhì)受體的類型是否有差異。將SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元的膜電位分別鉗制在-60mV、-40mV、-20mV、0mV、20mV，灌流?；撬?、GABA、glycine，根據(jù)?；撬?、GABA、glycine誘發(fā)電流的幅度和與其對應的鉗制電壓大小，繪制電流-電壓曲線，再利用Nernst公式計算?；撬崞胶怆娢?、GABA平衡電位和glycme平衡電位，從三種激動劑平衡電位的數(shù)值大小接近

12、何種離子平衡電位判斷它們引起何種離子的跨膜流動。配制不同濃度?；撬?0.01mM、0.03mM、0.1mM、0.3mM、1mM)、GABA(0.001mM、0.003mM、0.01mM、0.03mM、0.1mM)和glycine(0.003mM、0.01mM、0.03mM、0.1mM、0.3raM)，在全細胞膜片鉗的電壓鉗模式下，將細胞膜電位鉗制在-60mV，根據(jù)?；撬?、GABA、glycme誘發(fā)電流的幅度和與其對應的激動劑濃度，繪制濃

13、度-效應曲線，計算半最大效應濃度（concentrationfor50％ofmaximaleffect，EC50），比較三種激動劑對各自激活受體的親和性。觀察興奮性氨基酸受體阻滯劑(NBQX、APV)對?；撬嵴T發(fā)電流的影響。研究三種激動劑誘發(fā)電流的相互作用。誘發(fā)電流通過膜片鉗放大器后，經(jīng)A/D、D/A轉(zhuǎn)換器輸入計算機，然后進行采樣分析。<修稿日期>=
　　結(jié)果:牛磺酸、GABA、glycine的逆轉(zhuǎn)電位分別為-10.9±2.4mV

14、、-11.0±1.6mV、-11.8±1.1mV，均接近氯離子平衡電位-12.9mV，提示三種激動劑均能引起氯離子的跨膜流動。低濃度（0.1mM）、高濃度（1mM）?；撬嵴T發(fā)的電流，都被bicuculline（10μM，GABAA-R阻滯劑）部分阻斷，聯(lián)合加入strychnine（1μM，glycine-R阻滯劑）之后幾乎完全被阻斷，說明被阻斷的電流其實是牛磺酸激活GABA-R和glycine-R誘發(fā)的，證實不同濃度牛磺酸均能激活GAB

15、A-R和glycine-R。牛磺酸的EC50為0.074mM，GABA的EC50為0.008mM，glycine的EC50為0.022mM，牛磺酸的EC50大于GABA/glycine的EC50，說明誘發(fā)同樣幅度的氯離子跨膜流動，所需的?；撬釢舛却笥贕ABA/glycine，證實?；撬崾荊ABAA-R和glycine-R的低親和力激活劑，其對GABAA-R的激活效應低于GABA，對glycine-R的激活效應低于glycine。0.1m

16、M牛磺酸誘發(fā)的電流幅度不受NBQX（AMPA受體阻滯劑）、APV（NMDA受體阻滯劑）影響，證實?；撬岵患せ钆d奮性谷氨酸的AMPA受體和NMDA受體。同時灌流GABA和glycine誘發(fā)的電流幅度（actualcurrentsevokedbyacombinationofGABAandglycine，IGABA+Gly）小于單獨灌流GABA誘發(fā)電流幅度與glycine誘發(fā)電流幅度之和(expectedsumofcurrentsevoked

17、separatelybyGABAandglycine,IEX(GABA+Gly),證實GABA和glycine誘發(fā)電流之間存在“交叉抑制”;而同時灌流?；撬岷虶ABA誘發(fā)的電流幅度(actualcurrentsevokedbyacombinationoftaurineandGABA，ITau+GABA)大于單獨灌流?；撬嵴T發(fā)電流幅度（taurineevokedcurrents，ITau），也大于單獨灌流GABA誘發(fā)電流幅度（GABAev

18、okedcurrents，IGABA），但是與單獨灌流?；撬嵴T發(fā)電流幅度與GABA誘發(fā)電流幅度之和(expectedsumofcurrentsevokedseparatelybytaurineandGABA，IEX(Tau+GABA)之間無統(tǒng)計學差異，證實?；撬岷虶ABA誘發(fā)電流之間不存在“交叉抑制”;同時灌流牛磺酸和glycine誘發(fā)的電流幅度(actualcurrentsevokedbyacombinationoftaurinean

19、dglycine，ITau+Gly)大于ITau，也大于單獨灌流glycine誘發(fā)電流幅度(glycineevokedcurrents，IGly)，但是與單獨灌流?；撬嵴T發(fā)電流幅度與glycine誘發(fā)電流幅度之和(expectedsumofcurrentsevokedseparatelybytaurineandglycine,IEX(Tau+GIy)）之間無統(tǒng)計學差異，證實牛磺酸和glycine誘發(fā)電流之間不存在“交叉抑制”。
　

20、　結(jié)論:不同濃度?；撬峋杉せ頢D大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元的GABAA-R和glycine-R，這種效應是通過介導跨氯離子跨膜流動引起的。?；撬崾荊ABAA-R和glycine-R的低親和力激動劑。牛磺酸不激活興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的AMPA/NMDA受體。GABA和glycine誘發(fā)電流存在“交叉抑制”，然而?；撬崤cGABA誘發(fā)電流、?；撬崤cglycine誘發(fā)電流之間不存在“交叉抑制”。?；撬釋ABA/glycine誘發(fā)電流有協(xié)同效應。

21、?；撬峥赡芡ㄟ^激活SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元的GABAA-R和glycine-R降低神經(jīng)元興奮性，從而拮抗膽紅素興奮毒性。
　　第三部分牛磺酸通過激活GABAA-R/glycine-R拮抗膽紅素所致SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核興奮毒性
　　目的:膽紅素腦病會造成新生兒一過性或永久性的聽力損失，但是目前缺乏有效的治療新生兒膽紅素腦病的藥物。?；撬崾求w內(nèi)含量最豐富的氨基酸之一，主要通過激活GABAA-R和/或glycine-R起到抑制性

22、神經(jīng)遞質(zhì)的作用，也有神經(jīng)保護作用。既往研究顯示?；撬崮苻卓鼓懠t素引起的神經(jīng)元興奮毒性，但是只有形態(tài)學證據(jù)，缺乏對電生理機制的研究。本實驗目的在于從電生理方面探索牛磺酸對膽紅素所致SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核興奮毒性的抑制作用及其機制，為臨床治療新生兒膽紅素腦病提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法:急性單離出生后13-15天的SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元，采用穿孔膜片鉗記錄技術(shù)，在電流鉗模式下，給予細胞膜0pA的電流刺激，觀察膽紅素對神經(jīng)元動作

23、電位發(fā)放頻率的影響。為研究膽紅素對突觸前谷氨酸釋放的影響，在電壓鉗模式下，將細胞膜電位鉗制在-60mV，觀察膽紅素對腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元自發(fā)性興奮性突觸后電流(spontaneousexcitatorypostsynapticcurrents，sEPSCs)的作用。為探索膽紅素對突觸后谷氨酸受體敏感性的影響，研究膽紅素、?；撬釋劝彼嵴T發(fā)突觸后電流（glutamateevokedcurrents，IGlu）的作用。將腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元分為

24、兩組，第一組同時灌流膽紅素和?；撬?，記錄神經(jīng)元動作電位的發(fā)放頻率;第二組同時灌流膽紅素、?；撬?、bicuculline（GABAA-R阻滯劑）和strychnine（glycine-R阻滯劑），記錄神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率，并比較兩組動作電位發(fā)放頻率之間的差異。
　　結(jié)果:在電壓鉗記錄模式下，膽紅素能顯著增加sEPSCs的發(fā)放頻率，膽紅素組sEPSCs發(fā)放頻率為對照組的640.0±130.1％（P＜0.01，n=6），兩組sEPSC

25、s的幅度無差異（P＞0.05，n=6），證實膽紅素能促進突觸前谷氨酸釋放。在電流鉗記錄模式下，膽紅素誘發(fā)腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元動作電位大量發(fā)放，膽紅素組AP發(fā)放數(shù)量為對照組的848.0±223.2％（P＜0.01，n=5），沖洗掉膽紅素后，AP發(fā)放頻率仍高于對照組，為對照組的623.3±290.9％，但是組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，n=5），證實膽紅素會腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元超興奮，這種興奮效應即使在沖洗掉膽紅素之后的短時間內(nèi)仍然存在。膽紅

26、素和牛磺酸均不影響IGlu的幅度（P＞0.05，n=6），證實兩者均不影響突觸后谷氨酸受體敏感性。聯(lián)合灌流膽紅素和?；撬幔窠?jīng)元動作電位的發(fā)放數(shù)量較單獨灌流膽紅素組減少（P＜0.01，n=6），沖洗掉?；撬岷?，動作電位發(fā)放頻率下降，但是仍高于單獨灌流膽紅素組（P＜0.05，n=6），證實膽紅素能減輕膽紅素引起的腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元超興奮;聯(lián)合灌流膽紅素、?；撬帷icuculline和strychnine，神經(jīng)元動作電位發(fā)放數(shù)量與單獨灌流